一种检测猪水泡病毒抗原的酶联免疫试剂盒及定量检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于酶联免疫技术领域，具体设及一种检测猪水泡病毒抗原的酶联免疫试 剂盒及定量检测方法。
【背景技术】
[0002] 猪水泡病（Swine Vesicular Disease，SVD)是由小RNA病毒科肠道病毒属的病毒 引起的一种高度接触性传染病。它通过与感染猪的直接接触或污染的环境迅速传播，猪在 污染的环境中只需一天，就能产生病毒血症。潜伏期为2-7天。本病的临床症状与口蹄疫极 其相似，均W 口、鼻黏膜和蹄部、乳头部出现水瘤或溃烂为特征。与口蹄疫一样，也属于A类 传染病。该病最早发现于意大利（1966年），曾在我国大陆肆略一时，欧亚的许多国家也有爆 发流行。目前，其大规模流行已得到控制；但近些年，台湾、香港、意大利和葡萄牙等国有过 爆发。由于它与口蹄疫、水泡性口炎等疾病在临床症状上无法区分，必需进行实验室诊断， 所W对该病的技术储备必不可少。
[0003] 猪水泡病病毒(SVDV)为单股正链RNA，约7400核巧酸组成。基因组含一个单一的开 放阅读框，编码一个多聚蛋白前体，后者在感染细胞的胞浆中进一步加工，产生不同的病毒 聚多肤:第一次剪切产生P1、P2和P3,再次加工后，Pl产生了结构蛋白（￥?1、￥?2、￥?3和￥口4)， P2和P3产生非结构蛋白。在成熟的病毒粒子中，VPUVP2和VP3蛋白（分别为33、32和29kDa) 位于外表面，形成一个致密的蛋白外壳;相反，VP4(约7.5 kDa)位于衣壳的内部，与病毒RNA 分子相互作用。
[0004] SVDV是人源病毒柯萨奇B5(CV B5)的猪体变种，二者在分子结构和抗原性上的关 系暗示在1945-1965年的某个时间，CV B5跨越种间屏障，从人的病原变为一种猪的病原。 [000引在密度梯度离屯、时，SVDV完整病毒粒子的沉降系数为156S。其表面有5-7个中和位 点，还至少有7个抗原区，是猪水泡病灭活疫苗中诱导动物机体产生保护性免疫应答的主要 成分，其含量与抗原的免疫原性及疫苗的免疫保护效力明显相关。
[0006] 1984年，Ferris et al.建立了用紫外光定量检测薦糖梯度中猪水泡病完整病毒 粒子(156S)的方法。此后，该方法作为SVDV抗原定量的经典方法被大家广泛使用。但其缺点 是:仪器昂贵、操作复杂、重复性较差、不适合大批量样品检测。而且操作者的熟练程度及对 关键步骤的处理对实验结果影响很大，很难标准化。
【发明内容】
[0007] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种定量检测猪水泡病毒抗原的酶 联免疫试剂盒及猪水泡病毒抗原的定量检测方法，它W定量SVDV完整病毒粒子156S抗原 的薦糖密度梯度离屯、法为对照，建立了用多抗间接夹屯、化ISA检测SVDV细胞培养物及疫苗 中完整病毒粒子156S抗原的方法。运种方法既保留了密度梯度离屯、法的优势，又具有化ISA 的特长:敏感、特异、快速、简单、稳定性好、适合于批量检测，既可用于SVDV抗原增殖时的在 线监测，又可作为SVDV成品疫苗体外检验技术，评估疫苗的质量。
[0008] 本发明提供一种定量检测猪水泡病毒抗原的酶联免疫试剂盒，所述试剂盒包括猪 水泡病毒标准抗原、猪水泡病毒特异性第一抗体、猪水泡病毒特异性第二抗体和酶标抗体； 所述猪水泡病毒标准抗原的制备与赋值:将猪水泡病毒株进行病毒的复壮、繁殖和灭 活，得到灭活后的猪水泡病毒抗原，此即为标准抗原，将标准抗原用改进的薦糖密度梯度离 屯、法进行纯化和定量，得到猪水泡病毒标准抗原的含量； 所述改进的薦糖密度梯度离屯、法的步骤如下： (1) 在灭活的猪水泡病毒抗原中加入等体积的=氯乙締振摇，离屯、，取上层水相进行超 速离屯、； (2) 将沉淀用缓冲液重悬，加入NP40混匀； (3) 将不同浓度的薦糖按浓度从大到小依次加入到离屯、管中，平衡W形成密度梯度； (4)取步骤（2)中的重悬液加入到步骤（3)的离屯、管上层，超速离屯、，收集梯度液，在波长 260nm紫外分光光度仪检测，收取156S峰值处样品，计算出其含量； 所述猪水泡病毒特异性第一抗体的制备方法为:将猪水泡病毒抗原用薦糖密度梯度离 屯、法纯化，调整浓度，加入弗氏完全佐剂乳化，用其免疫兔子，免疫后采血分离血清，得到猪 水泡病毒特异性第一抗体； 所述猪水泡病毒特异性第二抗体的制备方法为:将猪水泡病毒抗原用薦糖密度梯度离 屯、法纯化，调整浓度，加入弗氏完全佐剂乳化，用其免疫豚鼠，免疫后采血分离血清，得到猪 水泡病毒特异性第二抗体。
[0009] 作为优选，所述酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的兔抗豚鼠抗体。
[0010] 作为优选，所述试剂盒还包括用于稀释猪水泡病毒特异性第二抗体的阻断稀释 液，所述阻断稀释液为:含体积百分比为10%正常牛血清和含体积百分比为5%健康兔血清的 PBSTo
[0011] 本发明还提供上述酶联免疫试剂盒的使用方法，是用猪水泡病毒特异性第一抗体 包被化ISA板，制成固相抗体，依次加入标准抗原或待检抗原样品、猪水泡病毒特异性第二 抗体、酶标抗体，再加底物溶液显色，加酸终止，测定〇D49〇nm值。
[0012] 本发明还提供上述酶联免疫试剂盒在定量检测猪水泡病毒抗原和猪水泡病毒疫 苗156S抗原中的应用。
[0013] 本发明还提供一种定量检测猪水泡病毒抗原的方法，用猪水泡病毒特异性第一抗 体包被化ISA板，制成固相抗体，依次加入不同浓度的标准抗原或待检抗原样品、猪水泡病 毒特异性第二抗体、酶标抗体，再加底物溶液显色，加酸终止，测定〇D49〇nm值;根据测定吸光 度值和标准抗原浓度绘制标准曲线方程，根据标准曲线方程和待检抗原样品的吸光度值来 计算待检抗原样品的浓度。
[0014] 作为优选，所述猪水泡病毒标准抗原的制备与赋值制备方法为：用猪水泡病毒株 进行病毒的复壮、繁殖和灭活，得到标准抗原;将标准抗原用改进的薦糖密度梯度离屯、法进 行纯化和定量，得到猪水泡病毒标准抗原的含量； 所述改进的薦糖密度梯度离屯、法的步骤如下： (1) 在灭活的猪水泡病毒抗原中加入等体积的=氯乙締振摇，离屯、，取上层水相进行超 速离屯、； (2) 将沉淀用缓冲液重悬，加入NP40混匀； (3)将不同浓度的薦糖按浓度从大到小依次加入到离屯、管中，平衡W形成密度梯度； (4)取步骤（2)中的重悬液加入到步骤（3)的离屯、管上层，超速离屯、，收集梯度液，在波长 260nm紫外分光光度仪检测，收取156S峰值处样品，计算出其含量； 所述猪水泡病毒特异性第一抗体的制备方法为:将猪水泡病毒抗原用薦糖密度梯度离 屯、法纯化，调整浓度，加入弗氏完全佐剂乳化，用其免疫兔子，免疫后采血分离血清，得到猪 水泡病毒特异性第一抗体。
[0015] 所述猪水泡病毒特异性第二抗体的制备方法为:将猪水泡病毒抗原用薦糖密度梯 度离屯、法纯化，调整浓度，加入弗氏完全佐剂乳化，用其免疫豚鼠，免疫后采血分离血清，得 到猪水泡病毒特异性第二抗体。
[0016] 作为优选，所述猪水泡病毒特异性第二抗体是用阻断稀释液稀释的，所述阻断稀 释液为:含质量百分比为10%正常牛血清和含质量百分比为5%健康兔血清的PBST。
[0017] 本发明还提供一种定量检测猪水泡病毒疫苗156S抗原的方法，将猪水泡病毒疫苗 先用正戊醇破乳，4°C，300化pm IOmin离屯、，吸出抗原部分，再用化ISA方法检测;所述化ISA 方法检测的具体方法为： 用猪水泡病毒特异性第一抗体包被化ISA板，制成固相抗体，依次加入不同浓度的标准 抗原或待检抗原样品、猪水泡病毒特异性第二抗体、酶标抗体，再加底物溶液显色，加酸终 止，测定〇D49〇nm值;根据测定吸光度值和标准抗原浓度绘制标准曲线方程，根据标准曲线方 程和待检抗原样品的吸光度值来计算待检抗原样品的浓度； 作为优选，所述猪水泡病毒标准抗原的制备与赋值:用猪水泡病毒株进行病毒的复壮、 繁殖和灭活，得到标准抗原;将标准抗原用改进的薦糖密度梯度离屯、法进行纯化和定量，得 到猪水泡病毒标准抗原的含量； 所述改进的薦糖密度梯度离屯、法的步骤如下： (1) 在灭活的猪水泡病毒抗原中加入等体积的=氯乙締振摇，离屯、，取上层水相进行超 速离屯、； (2) 将沉淀用缓冲液重悬，加入NP40混匀； (3) 将不同浓度的薦糖按浓度从大到小依次加入到离屯、管中，平衡W形成密度梯度； (4)取步骤（2)中的重悬液加入到步骤（3)的离屯、管上层，超速离屯、，收集梯度液，在波长 260nm紫外分光光度仪检测，收取156S峰值处样品，计算出其含量； 所述猪水泡病毒特异性第一抗体的制备方法为:将猪水泡病毒抗原用薦糖密度梯度离 屯、法纯化，调整浓度，加入弗氏完全佐剂乳化，用其免疫兔子，免疫后采血分离血清，得到猪 水泡病毒特异性第一抗体； 所述猪水泡病毒特异性第二抗体的制备方法为:将猪水泡病毒抗原用薦糖密度梯度离 屯、法纯化，调整浓度，加入弗氏完全佐剂乳化，用其免疫豚鼠，免疫后采血分离血清，得到猪 水泡病毒特异性第二抗体。
[0018] 作为优选，所述猪水泡病毒特异性第二抗体是用阻断稀释液稀释的，所述阻断稀 释液为:含质量百分比为10%正常牛血清和含质量百分比为5%健康兔血清的PBST。
[0019] 本发明先对SVDV抗原进行增殖、灭活，再用薦糖密度梯度离屯、法对SVDV抗原进行 定量(平行4-5次，保证至少有3次的结果接近），W它为标准抗原，对其它样品进行化ISA