液相芯片法hiv抗原抗体联合检测试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于免疫测定法领域，具体是一种液相忍片法HIV抗原抗体联合检测试剂 盒及检测方法。
【背景技术】
[0002] HIV感染检测包括P24抗原、HIV抗体、HIV病毒载量、CD4细胞计数等方法。目前临床 进行HIV血液筛查最常用的方法为酶联免疫吸附法化LISA) dHIV ELISA试剂到目前为止已 经发展到了第4代。目前国际和国内HIV检测的主流试剂和方法是第3代试剂，双抗原夹屯、法 检测标本中的抗体，酶标记物是特异性HIV抗原，可检测HIV不同的抗体亚型HIV-1/2/0 IgG/M/A，其检测的灵敏度和特异性高于第1、2代试剂，改善了0群标本的反应性，窗口期缩 短至22天。
[0003] 目前国际上有3种HIV-I确认实验方法，包括免疫印迹实验、免疫巧光实验和条带 免疫试验。卫生部颁布的《艾滋病检测技术规范》中规定我国HIV感染唯一的确认方法为免 疫印迹实验(WB)，也是证实HIV感染的最特异、最敏感的方法。WB是将HIV全病毒抗原经SDS-PAGE，把分子量大小不同的蛋白条带分开，然后再将运些不同分子量大小的蛋白电转到硝 酸纤维素膜上，再将该膜切割成条带状使每条硝酸纤维素膜上均含有经SDS-PAGE分离过的 HIV抗原。加入经缓冲液稀释的血清标本，若血清标本中含有HIV抗体，显色反应之后将会在 硝酸纤维素膜的相应位置显现出肉眼可见的条带。HIV免疫印迹实验判定标准为:形成至少 两条Env带(gp41、即120/即160)或者一条Env带加上p24带结果判定为阳性，出现带型不能 满足阳性判定标准结果判定为可疑，无任何HIV条带形成结果判定为阴性，能够鉴别初筛实 验的假阳性结果；在HIV病程的早期或晚期p31带常常缺失，可作为HIV病程的一个预测指 标。但是HIV免疫印迹实验有2%的假阳性率，大多见于有疫苗接种史和患有自身免疫性疾病 的患者。若将酶联免疫实验和免疫印迹实验结合起来检测HIV抗体，可W大大提高HIV抗体 的检出率(约99%)，假阳性率降低至0.0006。虽然WB基于HIV不同抗原组分的分离、浓缩及纯 化具有较高的特异性，但是WB和化ISA及其他检测方法相比检测成本高、实验技术要求严 格、影响因素较多，误判带型W及操作不当的假阳性率超过2%，初复检HIV阳性的4%-20%的 样品WB的检测结果为"抗体不确定"，一部分HIV抗体不确定标本与p24带有关系，运可能与 非特异性抗体有关。不确定的标本需3、6个月随访后方能确定，使无偿献血者个人、家庭、工 作和生活承受巨大的压力，也给工作人员带来诸多不便。
[0004] 被誉为后基因组时代忍片技术的液相忍片技术是20世纪90年代中期发展起来的， 液相忍片技术又称悬浮忍片技术、多功能悬浮点阵技术（Multi-Analyte Suspension Array，MASA)、Luminex技术或者是xMAP(flexible multiple-analyte profiling)技术。 液相忍片技术采用直径为5.6um的聚丙乙締微球作为检测载体，每个微球用红色和澄色两 种巧光染料进行编码，通过调整运两种巧光染料的比例能够获得100中不同巧光染色的微 球。当微球被635nm的激光照射后，微球能发射出658nm和71化m的巧光。每种微球的地址是 由两种巧光染料的比例唯一决定的，将每种编码微球共价偶联捕获分子运样每种编码微球 都有其对应的检测项目，进行检测时将进行不同待测物的微球与待测样本混合形成微球-捕获分子-待测物的混合物，最后加入链霉亲和素藻红蛋白（S化epavidin-phycoeiTt虹in, SA-PE)作为报告分子与混合物特异性结合，在一个反应相内最多可检测100种反应。新的 Luminex液相忍片系统采取=种巧光物质，通过调整=种巧光染料的比例，可W将微球分为 500 种。
[000引 Luminex-lOO/200/xMAP检测时，仪器抽取反应样品通过红色激光激发微球内部的 两种/ =种巧光物质信号接收器接收巧光信号，区分微球编号，确定微球上的捕获分子;绿 色巧光激发结合微球上的报道分子(藻红蛋白），结合的越多巧光信号越强，结果通过平均 巧光强度(Mean Fluorescent Intensity,MFI)判断。微球的信号和藻红蛋白信号同时被机 器识别，系统才认为是有效信号，运样就避免了其他物质的干扰提高了实验的特异性。
【发明内容】
[0006] 本发明就是为了克服HIV第S代试剂假阳性率高及WB检测的局限性的问题，所提 出的一种液相忍片法HIV抗原抗体联合检测试剂盒及检测方法。
[0007] 本发明是按照W下技术方案实现的。
[0008] 一种液相忍片法HIV抗原抗体联合检测试剂盒，包括由HIV抗原gp41、pl7、p24、 p31、p66、gpl20分别包被的微球，生物素化抗人二抗，SA-阳溶液;p24单克隆抗体包被的微 球，巧光素标记的与p24单克隆抗体配对的单克隆抗体。
[0009] 任一的所述HIV抗原甜41、pl7、p24、p31、p66、gpl20和p24单克隆抗体与微球的包 被比例为2-加 g的抗原或抗体包被1 X IO6个微球。
[0010] 所述生物素化抗人二抗为生物素化羊抗人抗体，生物素化抗人二抗浓度为4-8ug/ mlo
[0011] 所述与p24单克隆抗体配对的单克隆抗体为RDl标记的抗p24 KC57抗体;巧光素标 记的与p24单克隆抗体配对的单克隆抗体的浓度为0.5-lug/ml。
[001引所述SA-PE溶液的浓度为13-1加 g/ml;加入SA-PE溶液的反应时间为20-30min。
[0013] -种液相忍片法HIV抗原抗体联合检测试剂盒的检测方法 (1) 检测抗体:将抗原包被的微球与样本反应40-60min，再加入4-8ug/ml的生物素化抗 人二抗反应30-40min，最后加入13-1加 g/ml的SA-阳溶液反应20-30min，然后进行仪器检 测软件分析； (2) 检测抗原:将p24单克隆抗体包被的微球与样本反应40-60min，再加入0.5-lug/ml 的与p24单克隆抗体配对的单克隆抗体解育40-60min，最后进行仪器检测软件分析。
[0014] 每Iul样本加入4-8个抗原包被的微球进行反应。
[0015] 每Iul样本加入4-8个p24单克隆抗体包被的微球进行反应。
[0016] 本发明获得了如下有益效果。
[0017] 本发明仅需少量样本即可同时对HIV 6种抗体和P24抗原进行组合检测。并且本发 明与免疫印迹法相比具有很高的灵敏度和特异性:载体微球表面积大，每个微球上可包被 100 000个捕获抗体/抗原，如此高密度的捕获抗体/抗原保证了能够最大程度地与样本中 的抗原/抗体分子结合，提高检测灵敏度。本发明可在感染早期及时检出HIV抗体，实现HIV 感染的早发现、早干预，减少HIV传播，保证输血安全，具有广阔的应用前景。
【附图说明】
[001引图1是本发明口31、口24、口17、口66四种蛋白505斗466电泳图； 图2是本发明生物素化二抗浓度对MFI的影响图； 图3是本发明SA-阳加入浓度对MFI的影响图； 图4是本发明SA-PE反应时间对MFI的影响图； 图5是本发明实验加样方式对MFI的影响图。
【具体实施方式】
[0019]下面结合附图及实施例对本发明进行进一步的说明。
[0020] 1.甜17，p31, p66, p24表达质粒的构建及鉴定(抗原甜120、即41由万泰生物药 业股份有限公司合成） 1.1目的片段的扩增
参照NCBI上的HIV-I CRFOl-AE亚型甜 17，p31, p66, p24(Taxonomy ID: 471721)基 因全长，参考相关文献应用分析软件Primer 5设计引物，P24上游引入Nde I酶切位点同时 引入起始密码子ATG，下游引入Bam HI酶切位点。P17、P31、P66上游引入Bam HI酶切位点，下 游引入化nd III酶切位点。各引物序列如下所示:（引物由英潍捷基贸易有限公司合成） P24 上游： 下游： P17 上游： 下游： P31 上游： 下游： P66 上游： 下游： Whiv-I中国流行株CRFOl-AE基因 （Taxonomy ID: 471721)全长为模板在GeneAmp PCR system 9700 PCR仪（美国阳公司）上根据宝生物工程有限公司Pyrobest DNA Polymerase 试剂说明书配制PCR反应体系，如下所示： IOXPyrobest Buffer II (Mg^^ Plus) 5ul dNTP MixUire (各2.5mM) 4ul 上游引物（20 uM) Iul 上游引物（20 uM) Iul