一种多肽抗原检测牛结核分枝杆菌抗体的elisa试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术检测技术领域。
【背景技术】
[0002] 牛结核是由牛结核分枝杆菌引起的人兽共患传染病。在国际上已引起巨大经济损 失，牛结核可W感染其他反当动物和人类，野生动物是其储存宿主，给疾病控制与根除造成 很大困难。目前，用于牛结核标准诊断方法是用结核菌素进行皮内试验，该方法和其他细胞 介导的免疫学检测(如r-IFN试验，淋己细胞增生试验)均有一些优缺点。首先是由于皮内试 验是机体对抗原的迟发型变态反应，敏感性和特异性较低，也不可能确定对结核菌素反应 的是牛结核分枝杆菌，还是禽结核分枝杆菌，或是环境中的其他分枝杆菌。其次，在感染早 期细菌载量虽然较少，但W细胞介导的免疫反应为主，而在感染严重期细菌载量虽然较高 但细胞介导的免疫反应可能缺失，动物可能成为对细胞介导的免疫反应无应答。第=，72小 时内需要操作动物个体两次，W获得检测结果。第四，细胞介导的免疫学检测价格昂贵，需 要专业培训，解读检测结果。第五，环境中的分枝结核杆菌或BCG疫苗免疫的动物可能使检 测结果成为假阳性。因此，需要建立敏感、易操作和应用的检测牛结核的血清学方法，运种 方法能够区别牛结核和禽结核，或其他环境分枝结核杆菌。
[0003] 近年来有一些用于牧场检测的血清学方法，但敏感性较低，特异性也较差，或许是 由于使用了病原分支杆菌和环境分支杆菌表达的抗原提取物。运可W通过利用病原唯一抗 原进行加 W改进，而且已经取得一定进展。
【发明内容】
[0004] 为了克服现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种多肤抗原检测牛结核分枝 杆菌抗体的化ISA试剂盒。
[0005] 本发明包括牛结核分枝杆菌特异性多肤抗原包被的酶标板、阴性血清、阳性血清、 抗体稀释液、用辣根过氧化物酶标记的抗牛I gG酶标抗体、底物显色液、终止液;所述牛结核 分枝杆菌特异性多肤抗原为W下五种多肤抗原中的至少任意一种：
[0006] 所述五种多肤抗原为利用牛结核分支杆菌特异性多肤，采用体外人工合成方法取 得的多肤抗原。
[0007] 本发明利用人工合成多肤作为抗原，W获得灵敏度高、特异性高、操作简单、并快 速检测牛结核分枝杆菌抗体的化ISA检测试剂盒。
[0008] 本发明的有益效果:本发明采用牛结核分枝杆菌特异性多肤抗原作为包被抗原， 有效提高多肤与目标抗体的结合效率，从而显著提高可检测灵敏度，同时显著降低非特异 背景读值，特异性高，本发明的牛结核分枝杆菌抗体的化ISA试剂盒具有操作简单、诊断速 度快、在进行大规模检测中经济方便等优点，是一种便于普及的好方法，具有广泛的应用前 景。采用本发明的化ISA检测试剂盒检测牛结核分枝杆菌抗体，降低了检测成本，有利于推 广使用。
[0009] 进一步地，本发明所述牛结核分枝杆菌特异性多肤抗原包被的酶标板的制备方法 是:取96孔酶标板，每孔10化L牛结核分枝杆菌特异性多肤抗原，4°C过夜包被，包被浓度为 O.Oliig/mL~扣g/mL，用PBST洗涂液25化1/孔洗涂2~4次后拍干，用封闭液15化1/孔，37 °C封闭化，洗涂液PBST 25化1/孔洗涂3次后拍干，放入真空袋，4°C、抽真空保存。
[0010] 所述阳性血清为用抗体稀释液按照体积比为1:20~100的比例将牛结核分枝杆 菌标准阳性血清稀释后取得的稀释阳性血清;所述阴性血清为用抗体稀释液按照体积比为 1: 20~100的比例将牛结核分枝杆菌标准阴性血清稀释后取得的稀释阴性血清。所述标准 阳性、阴性血清用于评价试剂盒检测结果的有效性。
[0011] 所述抗体稀释液为0.1%BSA，W用于保持血清抗体的效价和稳定性，减少非特异 性。
[0012] 所述用辣根过氧化物酶标记的抗牛IgG酶标抗体是用HRP保护液按1:2000-1:5000 比例稀释后的抗牛IgG酶标抗体。保护液保护酶标抗体的稳定性和效价。
[0013] 所述底物显色液为TMB，使阳性样本呈现不同深浅颜色，从而判定阳性的强弱。
[0014] 所述终止液为0.1SDS%或2M的出S化，使酶促反应终止。
【具体实施方式】
[0015] -、本发明中所采用的牛结核分枝杆菌特异性多肤的制备方法： 1、利用牛结核分支杆菌特异性多肤，体外人工合成作为抗原快速检测牛结核分枝杆菌 的抗体。
[0016] 牛结核分枝杆菌多肤抗原的制备过程： 1)称取RINK树脂3 g(取代度0.3 mmol/g)于150 ml的反应器中，用50ml的二氯甲烧 (DCM)浸泡。
[0017] 2)2小时后，用3倍树脂体积的氮-二甲基甲酯胺(DM巧洗涂树脂，然后抽干，如此重 复四次，将树脂抽干后待用。
[001引 3)向反应器中加入一定量的20%赃晚（赃晚/DMF)，放在脱色摇床上摇晃20min，W 此来脱去树脂上的Fmoc保护基团。脱完保护后用3倍树脂体积的DMF洗涂四次，然后抽干。
[0019] 4)取少量树脂用巧S酬（九井水合巧S酬）法检测（检A、检B各两滴，100°C反应 Imin)，树脂有颜色，说明脱保护成功。
[0020] 5)称取C端第一个氨基酸适量和1-径基-苯拼S挫(册BT)适量于50ml的离屯、管中， 加入20ml的DM问尋其溶解，然后加入3ml的N，N-二异丙基碳二亚胺(DIC)振荡摇匀Imin,待溶 液澄清后加入到反应器中，然后将反应器置于30°C的摇床中反应。
[0021] 6)2小时后，用一定量的醋酸酢封头(醋酸酢：DIEA : DCM=1:1:2)半小时，然后用 3倍树脂体积的DMF洗涂四次，抽干待用。
[0022] 7)向反应器中加入一定量的20%赃晚（赃晚/DMF=I :4)，放在脱色摇床上摇晃20 min, W此来脱去树脂上的Fmoc保护基团。脱完保护后用DMF洗涂四次，然后抽干。
[0023] 8)取少量树脂用巧S酬（九井水合巧S酬）法检测（检A、检B各两滴，100°C反应 Imin)，树脂有颜色，说明脱保护成功。
[0024] 9)称取后面第二个氨基酸适量和册BT适量于50 ml的离屯、管中，加入25 ml的DMF 将其溶解，然后加入2.5 ml的DI讶辰荡摇匀Imin,待溶液澄清后加入到反应器中，然后将反 应器置于30°C的摇床中反应。
[0025] 10 ) 1小时后，取少量树脂检测，用巧S酬法检测（检A、检B各两滴，100°C反应 Imin),若树脂为无色，说明反应完全;若树脂有颜色，说明缩合不完全，继续反应。
[0026] 11)待反应完全后，用DMF洗涂树脂四次，然后抽干，向反应器中加入一定量的20% 赃晚（赃晚/DMF=I :4)，放在脱色摇床上摇晃20min，W此来脱去树脂上的Fmoc保护基团。脱 完保护后用DMF洗涂四次，然后抽干检测保护是否脱去。
[0027] 12)按照步骤9)至11)依次接上后面的氨基酸。
[00%] 13)待接上最后一个氨基酸后，脱去保护，用DMF洗涂四次，然后用甲醇将树脂抽 干。然后用95切割液(=氣乙酸：1，2乙二硫醇：3，异丙基硅烷:水=95:2: 2:1)将多肤从树脂 上切割下来(每克树脂加 IOml切割液），并用冰乙酸(切割液：乙酸=1:9)离屯、沉降四次。最后 用HPLC分离纯化，再冻干，得到一定纯度的多肤。
[0029] 2、牛结核分枝杆菌反应原性多肤的筛选： 通过DNASta;r、GenebankJrotScale等分析软件对牛结核分枝杆菌蛋白的抗原表位进 行预测，确定天然抗原的氨基酸序列，然后寻找该肤段所针对的抗原决定簇。使用化ISA检 测不同多肤与牛结核分枝杆菌抗血清的反应，最后选出具有良好反应的牛结核分枝杆菌反 应原性多肤。
[0030] 有效多肤段的选择和确定，通过DNAStarXenebankJrotScale等分析软件对牛 牛结核分枝杆菌蛋白的抗原表位进行预测，确定天然抗原的氨基酸序列，然后寻找该肤段 所针对的抗原决定簇(邱itopes)，使用化ISA检测不同多肤与牛结核分枝杆菌抗血清的反 应，最后选出具有良好反应的W下五种牛结核分枝杆菌多肤。
二、牛结核分枝杆菌特异性多肤抗原包被的酶标板的制备： 取96孔酶标板，每孔10化L上述任意一种牛结核分枝杆菌特异性多肤抗原，4°C过夜包 被，包被浓度为0.0化g/mL~化g/mL，用PBST洗涂液25化1/孔洗涂2~4次后拍干，用封闭 液15化1/孔，37°C封闭化，洗涂液PBST 250iil/孔洗涂3次后拍干，放入真空袋中，加入干 燥剂，抽真空，4°C保存。
[0032] S、组装试剂盒： 各试剂盒包括牛结核分枝杆菌特异性多肤抗原包被液包被的酶标板;阳性血清和阴性 血清各1管，其中阳性血清为牛结核分枝杆菌标准阳性血清，阴性血清为牛结核分枝杆菌 标准阴性血清；用辣根过氧化物酶标记的抗牛IgG的酶标抗体1瓶;抗体稀释液1瓶;底物 显色液I瓶;终止液I瓶。
[0033] 其中，阳性血清为用抗体稀释液按照体积比为1: 20~100的比例将牛结核分枝杆 菌标准阳性血清稀释后取得的稀释阳性血清。
[0034] 阴性血清为用抗体稀释液按照体积比为1:20~100的比例将牛结核分枝杆菌标 准阴性血清稀释后取得的稀释阴性血清。
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