抗苗勒管激素的荧光免疫层析检测方法及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种抗苗勒管激素的检测方法及试剂盒，尤其涉及抗苗勒管激素的荧光免疫层析检测方法及其检测试剂盒。
【背景技术】
[0002]传统的卵巢功能评估主要以年龄、滤泡刺激激素(FSH)、抑制素B(InhibinB)、雌激素(E2)、窦卵泡的数目(Antral follicle count)、卵巢大小(Ovarian volume)等作为指标，凭藉单一指标无法真实反应卵巢状况。近年来，研究发现抗苗勒管激素(Ant 1-Mullerian hormone，AMH)也参与女性卵巢功能调节，它对卵泡生长起一定的作用，可以作为不排卵妇女卵巢功能异常类型和程度的标记物。卵巢颗粒细胞释放的AMH在血清中可检测到，AMH的水平与发育的卵泡数成一定比例。因此，藉由侦测血液中AMH的量，便可做为评估卵巢库存水位的指标。选择AMH的好处如下:(I)随著年龄增长或卵巢功能开始衰退起始，在FSH、E2、Inhibin尚未产生变化时，AMH即可明确反应出衰退的徵兆，⑵在经期或非经期任意天测量AMH，变动性不大，⑶将AMH检测的数据结合其他指标可以更正确评估卵巢功能。
[0003]抗苗勒管激素(AMH)是一个140kDa、由二硫键连接的同源二聚体糖蛋白，是生长和分化因子超家族中转化生长因子家族(TGF-β)中的成员之一，类似于抑制素和激活素。AMH血清浓度准确地反映了窦状卵泡池的大小，代表了剩余原始卵泡的数量。AMH水平在相同年龄的妇女中变化显著。现有研究表明，在多数临床情况下，AMH是目前可用的最好的卵巢储备功能测定方法之一。体外受精联合胚胎移植技术(IVF)时，可用AMH来预测结果，其作用是预测卵巢反应情况、有助于建立卵巢超刺激的个体化给药。此外，AMH在预测生殖寿命，治疗卵巢功能失调(特别是多囊卵巢综合征)、性腺毒癌症治疗或卵巢手术的起着重要作用。
[0004]目前国内外开发的AMH试剂盒多采用酶免疫方法，该方法检测步骤多，操作过程产生的影响因素较多，检测结果易造成偏差。相对于上述检测方法，荧光层析免疫分析方法是一种微量分析方法，根据荧光强度，对物质进行定性或定量分析，具有高灵敏度、选择性强、需样量少和操作简便等优点。
[0005]中国专利CN103728459A公开了一种基于量子点的双夹心免疫荧光定量检测AMH的试剂盒，通过将量子点标记的AMH单克隆抗体、AMH和包被在酶标板上AMH特异性多克隆抗体结合，将荧光信号固定在酶标板上，通过荧光酶标仪检测荧光强度确定AMH的浓度。然而该方法检测步骤有酶标板的包被及封闭、标准品或被检血清的处理、单克隆抗体检测，检测过程中孵化时间长、洗板次数多，需要配套设备和专业人员。
[0006]中国专利CN104730247A公开了一种适于利用双标记时间分辨荧光免疫法快速检测AMH和INHB的试剂盒，采用镧系元素标记AMH的检测抗体，利用固定在固相载体上的AMH包被抗体和抗原AMH作用，将荧光物质固定在固相载体上达到检测AMH的目的，然而该方法在操作上需要孵化和洗板，同样具有操作复杂、检测灵敏度不高等缺点。
[0007]因此，如何开发检测时长短、操作方便、检测结果精确的抗苗勒管激素检测方法和检测产品成为亟待解决的问题。
【发明内容】
[0008]为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种灵敏度高、准确度高、操作简单、成本低的抗苗勒管激素的检测方法及试剂盒。
[0009]本发明一种抗苗勒管激素的荧光免疫层析检测方法，包括以下步骤:
[0010]步骤I)探针固定垫制备:将抗苗勒管激素单克隆抗体按比例与活化白蛋白荧光胶乳微粒偶联反应制得抗苗勒管激素单克隆抗体荧光胶乳微粒，再将所述抗苗勒管激素单克隆抗体荧光胶乳微粒与羊抗兔IgG荧光胶乳微粒按一定比例混合得到混合荧光胶乳微粒，所述混合荧光胶乳微粒用荧光探针微球稀释液稀释后喷在玻璃纤维上制得探针固定垫；
[0011]步骤2)免疫层析试纸条制备:将样品垫、探针固定垫、层析膜、吸水纸依次贴在PVC衬板上，将所述抗苗勒管激素单克隆抗体包被在层析膜的检测线上，将羊抗兔IgG包被在层析膜控制线上，进而制得免疫层析试纸条，所述层析膜优选硝酸纤维素膜；
[0012]步骤3)样品稀释液制备:将包括有牛血清白蛋白、表面活性剂、分散剂和防腐剂的混合物与缓冲液混合均匀制得样品稀释液；
[0013]步骤4)样品检验:取血清样品混合至所述样品稀释液，加入免疫层析试纸条进行免疫层析反应，层析反应结束后经荧光检测器荧光检测。
[0014]本发明进一步地，步骤I)中，所述活化白蛋白荧光胶乳微粒的制备是先将荧光胶乳微粒与活化剂反应制得活化荧光胶乳微粒，再与白蛋白按比例偶联反应得白蛋白荧光胶乳微粒，所述白蛋白与活化荧光胶乳微粒的比例为0.05:100?0.2:100，所述白蛋白荧光胶乳微粒进一步与活化剂反应制得所述活化白蛋白荧光胶乳微粒。
[0015]本发明更进一步地，所述白蛋白的种属包括人、牛、羊或鼠。
[0016]本发明更进一步地，步骤I)中，所述羊抗兔IgG荧光胶乳微粒的制备是将羊抗兔IgG按比例与活化荧光胶乳微粒偶联反应制得，所述羊抗兔IgG与活化荧光胶乳微粒的混合比例为0.05:100 ?0.2:100。
[0017]本发明更进一步地，步骤I)中，所述活化剂包括1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基硫代琥珀酰亚胺，二者重量比为1:6?1:1，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与荧光胶乳微粒的重量比为1:100?5:100。三者混合后可在室温下反应0.5?lh。
[0018]本发明进一步地，步骤I)中，所述抗苗勒管激素单克隆抗体与活化荧光胶乳微粒的混合比例为0.05:100?0.2:100,混合后可在室温下偶联反应I?5h;所述抗苗勒管激素单克隆抗体荧光胶乳微粒和羊抗兔IgG荧光胶乳微粒相混合的比例2:1?6:1，混合后室温下偶联反应I?5h。
[0019]本发明进一步地，步骤I)中，将混合荧光胶乳微粒用荧光探针微球稀释液稀释2?6倍，以2?6ul/cm的速度均匀喷在宽度为0.7?1.3cm的玻璃纤维上，在30?55°C下干燥2?24h后制得探针固定垫。
[0020]本发明进一步地，所述荧光探针微球稀释液为含有蔗糖、牛血清白蛋白和表面活性剂的缓冲液，所述缓冲液包括PBS缓冲液、Tr i s缓冲液、MES缓冲液、HEPES缓冲液中的一种或几种，所述表面活性剂为吐温20或吐温80。
[0021]本发明进一步地，步骤3)中，所述缓冲液包括PBS缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、MES缓冲液、HEPES缓冲液中的一种或几种，所述表面活性剂为吐温20、吐温80、曲拉通X-100或聚乙二醇，所述防腐剂为叠氮钠或proclin，所述分散剂为聚乙烯吡咯烷酮10K、聚乙烯吡咯烷酮40K或聚乙烯醇。
[0022]另一方面，本发明一种抗苗勒管激素的荧光免疫层析检测试剂盒，包括试剂盒体以及稀释液瓶，所述试剂盒体包括，所述免疫层析检测卡包括PVC衬板以及固定在PVC衬板上的样品垫、探针固定垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述样品垫搭接在探针固定垫上，所述探针固定垫和吸水纸分别搭接在所述硝酸纤维素膜两侧，所述硝酸纤维素膜上设置有检测线和控制线，所述检测线内包被有抗苗勒管激素单克隆抗体，所述控制线内包被有羊抗兔IgG;所述探针固定垫为由抗苗勒管激素单克隆抗体荧光胶乳微粒和羊抗兔IgG荧光胶乳微粒的混合荧光胶乳微粒干燥制得，在所述稀释液瓶中存放有样品稀释液。
[0023 ]本发明进一步地，所述免疫层析检测卡还包括壳体，所述壳体上设置有加样孔、检测窗口、