细胞毒性t细胞脱颗粒的流式细胞术检测方法

文档序号:9785197阅读:15001来源:国知局
细胞毒性t细胞脱颗粒的流式细胞术检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域,具体而言,涉及一种细胞毒性Τ细胞脱颗粒的流式细胞 术检测方法。
【背景技术】
[0002] 细胞毒性Τ细胞(Cytotoxic T_lymphocyte,CTL细胞)又称杀伤性Τ细胞,能够特异 性杀伤带抗原的靶细胞,如移植细胞、肿瘤细胞及受微生物感染的细胞等,与自然杀伤细胞 (Natural Killer cell,NK细胞)构成机体抗病毒、抗肿瘤免疫的重要防线。
[0003] CTL细胞杀伤靶细胞最主要途径一一细胞裂解性杀伤:与靶细胞接触后,可释放一 系列细胞毒颗粒物质(脱颗粒),从而导致靶细胞裂解。脱颗粒功能检测反映了 CTL细胞杀伤 活性,对于细胞毒功能学研究具有重要意义,是医学基础及临床研究中的一项重要工作。
[0004] 传统的对CTL细胞脱颗粒的检测多采用荧光镜检查,其具有检测速度慢、精度较 低、准确性较差等问题,使得检测结果不甚理想。
[0005] 有鉴于此,特提出本发明。

【发明内容】

[0006] 本发明的目的在于提供一种细胞毒性T细胞脱颗粒的流式细胞术检测方法,所述 的检测方法可解决现有技术检测速度慢、精度较低、准确性较差、检测结果容易受到检测者 的主观因素影响等问题。
[0007] 为了实现本发明的上述目的,特采用以下技术方案:
[0008] -种细胞毒性T细胞脱颗粒的流式细胞术检测方法,包括:通过抗体依赖的细胞介 导的细胞毒性作用激发细胞毒性T细胞脱颗粒,再用流式细胞术检测激发后与激发前细胞 毒性T细胞中囊泡膜蛋白标志物CD107a的平均荧光强度的比值来评价细胞毒性T细胞的脱 颗粒功能,若比值2 2.8提示脱颗粒功能正常。
[0009] 细胞毒性T细胞(Cytotoxic T-lymph〇Cyte,CTL细胞)胞浆内含有高浓度以囊泡形 式存在的细胞毒性颗粒。溶酶体相关膜蛋白l(CD107a)是囊泡膜蛋白的主要成分。CTL细胞 和NK细胞杀伤靶细胞时,毒性颗粒将到达细胞膜并与细胞膜融合(此时CD107a分子会被转 运到细胞膜表面),引起颗粒内容物释放,最终导致靶细胞的死亡。因此,CD107a分子是CTL 细胞脱颗粒的一种敏感标志,与细胞毒活性直接相关,可反映细胞毒性细胞杀伤活性水平。 此外,与颗粒胞吐有关的基因缺陷导致了 CD107a转移到细胞表面的功能受损。通过检测CTL 细胞表面表达的CD107a是鉴别是否存在颗粒胞吐功能缺陷的遗传性疾病的快速手段。 [0010] 流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒 子进行定量分析和分选的检测手段,它可以高速分析上万个细胞,并能同时从一个细胞中 测得多个参数。通过自然杀伤作用或抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用激发CTL细胞脱 颗粒后,再使用流式细胞术对其CD107a分子增加的幅度进行检测,可以快速、精度地评价 CTL细胞的脱颗粒能力。
[0011] 如上所述的检测方法,具体包括以下步骤:
[0012] 1)、分离待检样本中的外周血单个核细胞及并计数调整细胞浓度;
[0013] 2)、取细胞毒性T细胞天然靶细胞并计数调整细胞浓度;
[0014] 3)、将步骤1)中的所述外周血单个核细胞和步骤2)中的所述细胞毒性T细胞天然 靶细胞按体积比等比混合后平均分成两组,向其中一组中加入抗人⑶3抗体作为实验组,另 一组作为对照组;将两组孵育后离心并弃上清,得到沉淀;
[0015] 4)、加入流式染色缓冲液重悬步骤3)中所述沉淀,同时加入抗⑶3、⑶8、⑶107a的 流式抗体并孵育;
[0016] 5)、待孵育完成后离心,用流式染色缓冲液洗涤沉淀;
[0017] 6)、洗涤后用流式染色缓冲液重悬混匀细胞并用流式细胞仪进行检测;
[0018] 7)、统计⑶3+⑶8+D107a+的细胞中⑶107a的平均荧光强度,并计算实验组与对照 组的平均荧光强度的比值用以评价细胞毒性T细胞的脱颗粒功能,若比值2 2.8提示脱颗粒 功能正常。
[0019] Q)3(cluster of differentiation 3,分化簇3)受体仅存在于T细胞表面,因而可 用作T细胞的标志物;
[0020] Q)8(cluster of differentiation 8,分化簇8)受体表达于细胞毒性T细胞上,可 作为细胞毒性T细胞的标志物;
[0021 ]⑶107a分子作为CTL细胞脱颗粒的敏感标志物。
[0022] 步骤3)中加入的抗人CD3抗体选用购自4abio公司,目录号为FHF003-100的Mouse anti Human CD3 Monoclonal Antibody,FITC或目录号为FHU003-100的Mouse anti-Human CD3 Monoclonal Antibody,Purified;
[0023] 步骤4)中加入的三种抗体,CD3抗体(Anti-Human CD3 FITC 100 tests)购自 eBioscience公司,目录号为11-0036-42,或采用购自4abio公司,目录号为FHF003-100的 Mouse anti-Human CD3 Monoclonal Antibody,FITC;CD8抗体(PerCP anti-human CD8)购 自Biolegend公司,目录号为344708;CD107a抗体【Anti-HumanCD107a(LAMP-l)PE 100七68七8】购自613;[08(^61106公司,目录号为12-1079-42。
[0024] 优选的,如上所述的检测方法,所述细胞毒性T细胞天然靶细胞为P815细胞。
[0025] Ρ815细胞为肥大细胞瘤细胞,可通过抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC) 激发细胞毒性Τ细胞脱颗粒。
[0026]优选的,如上所述的检测方法,在步骤3)中,抗人⑶3抗体的浓度为0.25~0.5yg/ 100μ1〇
[0027]优选的,如上所述的检测方法:
[0028] 在步骤1)中,所述细胞浓度为1 · 8~2 · 2 X 106/ml;
[0029] 在步骤2)中,所述细胞浓度为1 · 8~2 · 2 X 106/ml。
[0030] 优选的,如上所述的检测方法,在步骤3)中,孵育条件为:
[0031] 于37°C,5%C〇2培养箱中共孵育2.5~3.5h。
[0032] 优选的,如上所述的检测方法,在步骤4)中,孵育条件为:
[0033] 室温避光孵育15~25min。
[0034]优选的,如上所述的检测方法,所述流式染色缓冲液的配方为:
[0035] 含有2·0%FBS和2·0mMEDTA的lXPBS溶液。
[0036] 优选的,如上所述的检测方法,在步骤2)、步骤3)和步骤5)中,所述离心的转速均 为1200~1600rpm,离心时间均为4~6min。
[0037] 优选的,如上所述的检测方法:
[0038] 在步骤4)中,CD3、CD8的抗体的浓度为0.45~1.0yg/100yl;CD107a的抗体浓度为 0.06~0.125yg/100yl。
[0039] 与现有技术相比,本发明的有益效果为:
[0040] 1)、本申请提供的细胞毒性T细胞脱颗粒的流式细胞术检测方法,检测快速,通量 大,准确度高,且人为因素影响较小。
[0041 ] 2)、通过对天然刺激物的选择、效靶细胞配比及孵育时间等关键技术细节进行优 选限定,建立了稳定规范的技术流程。
【附图说明】
[0042] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,以下将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0043] 图1为通过抗人⑶3抗体及靶细胞P815激发的CTL细胞脱颗粒,进而通过流式细胞 术进行检测的实验结果图;图A为激发前,图B为激发后。
【具体实施方式】
[0044]下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述,但是本领域技术人员将会 理解,下列实施例仅用于说明本发明,而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体 条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为 可以通过市售购买获得的常规产品。
[0045] 实施例1
[0046] 细胞毒性T细胞脱颗粒的流式细胞术检测方法,包括以下步骤:
[0047] S11、分离待检样本中的外周血单个核细胞及并计数调整细胞浓度;
[0048] S12、取细胞毒性T细胞天然靶细胞并计数调整细胞浓度;
[0049] S13、将步骤SI 1中的所述外周血单个核细胞和步骤S12中的所述细胞毒性T细胞天 然靶细胞按体积比等比混合后平均分成两组,向其中一组中加入抗人⑶3抗体作为实验组, 另一组作为对照组;将两组孵育后离心并弃上清,得到沉淀;
[0050] S14、加入流式染色缓冲液重悬步骤S13中所述沉淀,同时加入抗⑶3、⑶8、D107a的 流式抗体并孵育;
[0051 ] S15、待孵育完成后离心,用流式染色缓冲液洗涤沉淀;
[0052] S16、洗涤后用流式染色缓冲液重悬混匀细胞并用流式细胞仪进行检测;
[0053] S17、统计⑶3+⑶8+的细胞中⑶107a的平均荧光强度,并计算实验组与对照组的平 均荧光强度的比值用以评价细胞毒性T细胞的脱颗粒功能,若比值2 2.8提示脱颗粒功能正 常。
[0054] 实施例2
[0055]细胞毒性T细胞脱颗粒的流式细胞术检测方法,包括以下步骤:
[0056] S21、分离待检样本中的外周血单个核细胞及并计数调整细胞浓度至1.8 ΧΙΟ6/ ml;
[0057] S22、取细胞毒性T细胞天然靶细胞P815细胞并计数调整细胞浓度至1.8 X 106/ml;
[0058] S23、将步骤S21中的所述外周血单个核细胞和步骤S22中的所述细胞毒性T细胞天 然靶细胞按体积比等比混合后平均分成两组,向其中一组中加入抗人⑶3抗体作为实验组 (抗体的浓度为0.
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