Mops残留量的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于MOPS检测技术领域涉，尤其涉及一种MOPS残留量的检测方法。
【背景技术】
[0002] 3-(N-吗啉）丙横酸，英文名称：3-(N_Morpholino)propane-sulfonic acid，缩写 为MOPS，分子式:C7H15N04S，分子量:209.2633，pH值范围：6.5-7.9，为白色结晶粉末，熔点为 277-282°Γ . 2〇°Γ时的水滚忡为1 000g/L，相对密度为1 · 298g/cm3，其结构式如下所示：
[0003]
[0004] MOPS作为一种常用的生物缓冲溶液，可用于较多生物制品的生产纯化。因此，生物 制品中MOPS的残留量与生物制品的纯度直接相关，检测MOPS残留量具有重要的意义。然而 中国药典、美国药典中的残留溶剂测定法以及《ICH Q3c杂质：中残留溶剂的指导原则》中， MOPS均不属于第一至第四类溶剂的限度要求。中国科学院化学物质毒性数据库中，MOPS鹌 鹑口服的LD50为>316mg/kg，折算成人剂量为>52 · 67mg/kg。
[0005] 上海博唯生物科技有限公司在生产重组人乳头瘤病毒疫苗(HPV)的纯化过程中使 用MOPS作为缓冲溶液，为保证疫苗的安全性，需要对生产工艺过程中使用的所有可能有毒 的物质进行残留量检测。纯化后的HPV疫苗成品中MOPS残留量折算成人剂量为0.0009mg/kg (远远小于52.67mg/kg)，用常规化学滴定法检测不出。同时，MOPS为两性化合物，具有较大 的极性，用常规C18柱进行高效液相色谱(HPLC)分析时，也无保留或无紫外吸收。针对微量 MOPS检测方法或MOPS残留量的检测方法目前还没有相关报道。因此迫切需要一种检测微量 MOPS残留量的方法，以确定HPV疫苗成品中MOPS残留量符合纯度的要求，保证生物制品的安 全性。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种MOPS残留量的检测方法，以克服现有技术不能检测微 量MOPS残留的缺陷，能够检测出HPV疫苗成品中MOPS残留量，确保了HPV疫苗成品的安全性， 具有检测精密度、检测灵敏度和准确性高的特点。
[0007] 本发明的第一个方面，提供了一种MOPS残留量的检测方法，该方法以高效液相色 谱法进行检测，采用线性归一法对MOPS进行定量。
[0008] 所述高效液相色谱法的色谱柱为Acclaim Trinity P1。
[0009] 所述高效液相色谱法采用电喷雾检测器。
[0010] 所述高效液相色谱法的流动相为乙腈和醋酸铵溶液混合液，体积比为1:1~2:1。
[0011] 所述流动相的流速为0.4~0.6ml/min。
[0012]本发明的另一个方面，提供了所述的MOPS残留量的检测方法在生物制品的MOPS残 留量检测中的应用。
[0013] 根据本发明的优选实施例，所述生物制品为HPV疫苗。
[0014] 本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：
[0015] 1)本发明的一种MOPS残留量的检测方法，采用高效液相色谱进行检测，色谱柱为 Acclaim Trinity P1，能够检测出化学滴定法及C18柱液相色谱检测不出的HPV疫苗中的微 量MOPS成分，为HPV疫苗或含有微量MOPS成分生物制品的安全性提供了很好的保证。
[0016] 2)本发明的MOPS残留量的检测方法具有良好的检测精密度，且其检测灵敏度和准 确性高，可广泛应用于生物制品的MOPS残留量的检测。
【附图说明】
[0017]图1为浓度1.0mm〇l/L的MOPS标准溶液分离图谱；
[0018] 图2为空白对照及1.0mmol/L MOPS标准溶液（空白对照稀释）的对照图谱，图中较 上的曲线表示1.0mm〇l/L MOPS标准溶液(空白对照稀释)分离曲线，较下的曲线表示空白对 照的分离曲线。
[0019] 图3为浓度0. lmmol/L~5.0mmol/L的MOPS标准溶液的线性叠加图谱，图中由下至 上曲线浓度分别为：0· lmmol/L、0· 2mmol/L、0· 5mmol/L、1 ·0mmol/L、5·0mmol/L。
[0020] 图4为四个批次样品的分离图谱。
【具体实施方式】
[0021] 以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本 发明而非用于限制本发明的范围。
[0022] 本发明采用的试剂、药品或仪器皆为市售，其中MOPS标准品（上海源聚生物科技有 限公司，纯度:99.6%)，乙腈(色谱纯），高效液相色谱仪(型号:1]出11^6 3000)。
[0023] 分析溶液配制步骤:
[0024] 流动相制备：
[0025] 1)称取1.54g醋酸铵溶于1000ml去离子水中，搅拌均匀制备得到0.02m〇VL的醋酸 铵溶液，滴加醋酸调节pH至5.0。
[0026] 2)配置乙腈和醋酸铵溶液的混合溶液，体积比为1.5:1，摇匀得到流动相。浓度 0.1謹ol/L~5 · Ctamol/LMOPS标准溶液的配制：
[0027] 准确称取1.045克MOPS标准品加去离子水定容到1L，即得浓度为5.0mmol/L的标准 溶液，再分别稀释成1.0、0.5、0.2、0. lmmo 1/L的MOPS标准溶液。
[0028] 空白对照（样品空白缓冲溶液）的配制：称取NaCl 28.4g，组氨酸3.08g，加入聚山 梨酯-800.2ml后，加适量超纯水溶解，用盐酸调pH值至6.2，加超纯水定容至1000ml。
[0029] 1 .Ommol/L MOPS标准溶液（空白对照稀释）：用样品空白缓冲溶液稀释5.0mmol/L 的标准溶液至1. Ommol/LMOPS标准溶液。
[0030] 具体色谱条件:采用高效液相色谱技术分析HPV疫苗中的微量MOPS残留，具体参数 如表1所示。
[0031] 表1色谱条件
[0032]
[0033」 参考例1:
[0034] 采用高效液相色谱法检测浓度为1.0mmol/L的标准溶液，得到标准溶液的分离图 谱，如图1所示。由图1可以看出，浓度为1. Ommo 1/L的MOPS标准溶液在保留时间为2.47min处 出现MOPS特征峰。
[0035] 参考例2:
[0036] 采用高效液相色谱法分别对空白对照(0mmol/L MOPS)及1.0mmol/L MOPS标准溶 液(空白对照稀释)进行检测，得到对照图谱如图2所示。
[0037]由图2可以看出，空白对照进样后没有检测出MOPS特征峰，而1.0mmol/L MOPS标准 溶液(空白对照稀释)在保留时间为2.49min处可检测出明显的MOPS特征峰。
[0038] 注:MOPS采用液相色谱检测的正常保留时间在2.40±0.10min范围之间。
[0039]实施例 1-3:
[0040] 分别对3份1. Ommo 1/L的MOPS标准溶液进行定量检测，检测条件：色谱柱:Acclaim Trinity P1，柱温分别为30°C，35°C，40°C，雾化温度分别为25°C，30°C，35°C，流动相：乙腈 和醋酸铵溶液的混合液，体积比分别为1.1:1，1.5:1，2:1，流速分别为:0.4ml/min，0.5ml/ 111；[11，0.61111/111；[11，进样量分别为 :3以1^，5以1^，1(^。检测结果如表1所示。
[0041] 表11.0mmol/L MOPS标准品在不同检测条件下的检测结果
[0042]
[0043] 由表1可以看出，实施例卜3的检测条件下均能检测出MOPS，且保留时间在2.44min 左右，峰面积相近，说明实施例1-3的色谱条件均能实现微量MOPS的检测，而实施例2条件下 所得色谱峰的对称性最好，因此实施例2的色谱条件较优。
[0044] 实施例4:
[0045] 对8份lmmol/L的MOPS标准溶液进行定量检测，检测条件：色谱柱为Acclaim Trinity P1，柱温为35°C;雾化温度为30°C，流动相：乙腈和醋酸铵溶液的混合液，体积比为 1.5:1，流速:0.5ml/min，进样量:5yL。
[0046] 所得MOPS的相对标准偏差RSD ( % )为：1.89 %，说明本申请的检测方法具有良好的 精密度。
[0047] 实施例5-9:
[0048] 分别检测浓度为0 · lmmol/L(定量限）、0 · 5mmol/L、1 · 0mmol/L、2 · 0mmol/L、 5.0mmol/L的MOPS标准溶液，检测条件:色谱柱:Acclaim Trinity PI，柱温为35°C;雾化温 度为30°C，流动相：乙腈和醋酸铵溶液的混合液，体积比为1.5:1，流速:0.5ml/min，进样量： 5yL，得到线性叠加图谱如图3所示，对应的浓度-峰面积对应关系如表2所示：
[0049] m?.
[0050]
[0051 ]由图3可以看出，浓度不同的MOPS标准溶液均在保留时间为2.49min处出现MOPS特 征峰。由表2可以得出，相关系数R2为0.9990，所以用该方法测定MOPS残留量，浓度在定量限 至5mmol/L之间呈现良好的线性。
[0052]分析方法的检测限DL和定量限QL由信噪比（S/N)计算，以本发明提供的方法进行 检测，检测限为0.05mmol/L，定量限为O.lmmol/L。说明本发明的检测方法灵敏度高。
[0053] 实施例10:
[0054]将4个批次的样品，通过高效液相色谱仪进样分析，检测四个批次的样品中的微量 MOPS残留量。检测条件:色谱柱为Acclaim Trinity P1，柱温为35°C;雾化温度为30°C，流动 相：乙腈和醋酸铵溶液的混合液，体积比为1.5:1，流速为:0.5ml/min，进样量为:5yL，四个 批次样品的分析叠图如图4所示，对应的MOPS残留量分析结果如表3所示。
[0055]表3样品分析结果
[0056]
[0057]由图4可以看出，检测的4个不同批次的样品均出现了 MOPS特征峰，四个样本的谱 图曲线基本重叠，保留时间均在2.40min左右，且MOPS特征峰面积基本相同，说明本发明的 技术方案能够检测出样本中微量的MOPS，且准确性高。
[0058]由表3的结果可以看出，最终测出MOPS残留量在0.10mmoL/L左右，说明本发明的检 测方法能够检测出HPV疫苗中的微量的MOPS残留，且检测性能稳定，准确性高。
[0059]虽然以上实施例仅对HPV疫苗中的微量MOPS残留进行了检测，但是本领域的技术 人员容易理解，本发明的方法对于生产过程中使用MOPS的其他生物制品同样适用，这是显 而易见的。对于本领域技术人员而言，任何对该实用进行的等同修改和替代也都在本发明 的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本 发明的范围内。
【主权项】
1. 一种MOPS残留量的检测方法，其特征在于，以高效液相色谱法进行检测，采用线性归 一法对MOPS进行定量。2. 如权利要求1所述的一种MOPS残留量的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱法 的色谱柱为Acclaim Trinity P1。3. 如权利要求1所述的一种MOPS残留量的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱法 采用电喷雾检测器。4. 如权利要求1所述的一种MOPS残留量的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱法 的流动相为乙腈和醋酸铵溶液混合液，所述乙腈与醋酸铵溶液体积比为1:1~2:1。5. 如权利要求1所述的一种MOPS残留量的检测方法，其特征在于，所述流动相的流速为 0·4~0·6ml/min〇6. 如权利要求1 -5中任一项所述的MOPS残留量的检测方法在生物制品的MOPS残留量检 测中的应用。7. 如权利要求6所述应用，其特征在于，所述生物制品为HPV疫苗。
【专利摘要】本发明提供一种MOPS残留量的检测方法，以高效液相色谱法进行检测，采用线性归一法对MOPS进行定量。所述高效液相色谱法的采用Acclaim？Trinity？P1色谱柱和电喷雾检测器，流动相为乙腈和醋酸铵溶液混合液，乙腈与醋酸铵溶液的体积比为1:1～2:1，流动相流速为0.4～0.6mL/min。本发明的MOPS残留量的检测方法，能够检测出化学滴定法及C18柱液相色谱检测不出的HPV疫苗中的微量MOPS成分，具有良好的检测精密度，且其检测灵敏度和准确性高，可广泛应用于生物制品的MOPS残留量检测。
【IPC分类】G01N30/60, G01N30/06
【公开号】CN105548420
【申请号】CN201511022203
【发明人】周朝明
【申请人】上海博唯生物科技有限公司
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2015年12月30日