一种沼液中游离氨基酸的检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及沼液的综合开发技术领域，涉及对样品进行前处理所需的技术，以及 所开发的适应现代检测仪器一次性分析沼液中24种游离氨基酸的检测方法。
【背景技术】
[0002] 目前，剩余污泥的产生量随着城镇污水处理能力的高速发展而迅速增加。截止至 2013年，我国剩余污泥的年产生量就已经达到625万t (以干基计）。其中的大部分并未得到 合理、安全的处理和处置。剩余污泥中富含氮、磷、钾等营养元素，有机质含量可达50%_60%。 厌氧消化是一种在实现污泥的稳定化同时产生作为能源的沼气的技术，可以作为污泥处理 处置的合适选择。在污泥厌氧消化过程中，除碳源以外的大部分营养物质都保留在沼液和 沼渣中，尤其是氮、磷和钾等在沼液中的含量很高。并且经厌氧消化后，有机物大部分以简 单的、易于被动植物吸收的小分子或离子状态存在。这使得沼液和沼渣农用资源化开发成 为当前国内外污泥处理处置技术研究的热点之一。
[0003] 在厌氧消化过程中，有机氮中一部分被转化为氨态氮，另一部分则参与代谢或分 解为氨基氮如游离氨基酸等的形式。氨基酸对植物生长特别是光合作用具有独特的促进作 用，尤其是甘氨酸，它可以增加植物叶绿素含量，提高酶的活性，促进二氧化碳的渗透，使光 合作用更加旺盛，对提高作物品质，增加维生素 C和糖类的含量都有着重要作用。因此为了 解沼液中氮组分组成和存在形态以指导污泥综合利用，建立快速、有效的氨基酸测试方法 显得尤为重要。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种沼液中24种游离氨基酸的检测方法。
[0005] 本发明通过pH调节和旋蒸去除沼液氨氮和挥发性生物胺，使用Mill ipore新型超 滤离心管去除大分子物质，然后联合柱前衍生-反向-高效液相的方法对沼液游离氨基酸做 了分析，为厌氧消化过程中蛋白质降解机理研究提供基础，并且为沼液和沼渣农用资源化 开发利用提供科学依据。
[0006] 为了实现本发明的技术目的，采用如下技术方案：一种沼液中24种游离氨基酸的 检测方法，包括调节沼液pH至10.2后旋蒸去掉沼液内高浓度的氨氮和挥发性生物胺，运用 0.5ML 3K Millipore超滤离心管去除大分子干扰物，运用邻苯二甲醛(0ΡΑ)及氯甲酸9-芴 基甲酯(FM0C)两种衍生化试剂对氨基酸进行柱前衍生化使得氨基酸具有荧光发射特征来 提高检测灵敏度和分离选择特性，然后运用反向-高效液相对24种氨基酸进行定性定量分 析;具体步骤如下： (1)、仪器和试剂的选择 所用仪器为Agilent-1260液相色谱仪，配有在线脱气机、四元梯度栗、标准自动进样 器、荧光检测器（FLD)及Agilent化学工作站；17种氨基酸的混合标准：天冬氨酸、丝氨 酸、色氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、缬 氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸及苯丙氨酸，补充氨基酸(天门冬酰胺、谷氨酰胺、瓜氨酸、 正缬氨酸、赖氨酸、羟脯氨酸、肌氨酸）以及衍生化试剂邻苯二甲醛(〇PA，HPLC)、3-巯基丙酸 (3-MPA，HPLC)和氯甲酸9-芴基甲酯(FMOC，HPLC)均为Sigma( St Louis，MO，USA)产品。甲 醇、乙腈为HPLC级试剂;实验用水是Milli-Q水（Millip〇re，USA);其他试剂均为优级纯， 内标物α-氨基丁酸； (2 )、样品的制备 (2.1) 样品的前处理 将沼液过0.22μπι的滤膜去掉颗粒物，用1Μ氢氧化钠调节过滤后的滤液pH值至10.2，取 上述沼液5ml于50ml旋蒸前型瓶中于40°C下抽真空旋转蒸发至干，以去掉高浓度氨氮和挥 发性生物胺，用5ml 0.1M盐酸重新溶出，涡旋30s混匀，得到重新溶出液;取所述重新溶出 液200yL于0.5ML 3K Mliipore超滤离心管内，13000g离心至所有液体通过，祸旋混勾置于4 °C待用； (2.2) 样品的衍生化处理 在0.5微升的步骤(2.1)所得样品中混合0.5微升的0PA和0.5微升的FM0C，接着用32微 升的每100ml流动相A加400微升的磷酸的混合溶液稀释，所得溶液用于RT-HPLC分析;混合 时间为2min，可通过安捷伦HPLC自动进样程序自动混合，来严格控制各反应时间。
[0007] (3)、RT_HPLC 色谱条件 色谱柱：Agilent Zorbox Eclipse AAA 柱（3.5 μηι，4· 6mm X 150 mm); 流动相A 为0· 04 mol /L NaH2P〇4( lOmol/L NaOH 调至pH = 7. 8);流动相B 为超 纯水：乙腈：甲醇为10: 45: 45( V /V /V); 焚光检测波长:Ex = 340 nm，Em = 460 nm，PMT=10;15·25min换波长Ex = 266 nm，Em =305 nm ,PMT=9； 流速:2ml/min〇
[0008] 柱温:40°C; 流动相洗脱梯度见表1.
14)忮步骤Uij所还ΚΓ-此Lunin汆忏对步骤U)处埋后的杵不上机测讯，侍到虱垂酸甘 布谱图。采用保留时间法对样品中氨基酸定性，即在相同的色谱分析条件下，样品中氨基酸 的色谱峰与氨基酸标准的色谱峰保留时间相同或相近，则认为样品中含有此氨基酸。在每 次衍生化反应之前，将内标物加入到样品中，采用内标工作曲线法对样品中游离氨基酸的 浓度进行定量分析。
[0009]本发明与现有前处理方法和检测方法相比，具有如下优点： 1、沼液呈黄色，有许多细小固体悬浮物，成分复杂，干扰组分较多，加上浓度极高的氨 和挥发性胺会与某些待测氨基酸形成荧光副产物，干扰氨基酸的分析测定，对于这些干扰 物的去除，本发明创新性的采用了调节沼液pH至10.2后40°C下低压旋转蒸发去除氨氮和挥 发性生物胺，运用0.5ML 3K Mliipore新型超滤离心管的方式去除大分子干扰物，避免了常 规采用的（强）阳离子固相萃取小柱(SCX-SPE)去除干扰物过程中干扰物与氨基酸的非选择 性吸附的缺点。
[0010] 2、本发明所涉及方法与常规的（强）阳离子固相萃取小柱(SCX-SPE)去除干扰物的 方式相比，避免了由于氨基酸的等电点不同而引起的SCX-SPE对氨基酸的选择性，以及测定 样品时回收率低和重现性差的缺点。步骤简单，可操作性强。
[0011] 3、本发明采用两种衍生化试剂0PA-FM0C联用并联合Millipore新型超滤离心管实 现了沼液内24种氨基酸的全分析。
【附图说明】
[0012] 图1为本发明的氨基酸标准样品得到的谱图。
[0013]图2、3为实施例1中5%反应器和20%反应器产生沼液样品得到的谱图。
[00M]图4两种不同前处理方法得到的沼液中DFAA液相色谱对比图，（a)pH2.2条件下通 过SCX前处理得到的沼液中DFAA色谱图（b)Millip〇re新型超滤离心管前处理得到的沼液 中DFAA色谱图。
[0015]图中标号：1-天门冬氨酸，2-谷氨酸，3-天门冬酰胺，4-丝氨酸，5-谷氨酰胺，6-组 氨酸，7-甘氨酸，8-苏氨酸，9-瓜氨酸，10-精氨酸，11-丙氨酸，12-酪氨酸，13-α-氨基丁酸， 14-胱氨酸，15-缬氨酸，16-蛋氨酸，17-正缬氨酸，18-色氨酸，19-苯丙氨酸，20-异亮氨酸， 21-亮氨酸，22-赖氨酸，23-羟脯氨酸，24-肌氨酸，25-脯氨酸。
【具体实施方式】
[0016]下面通过实施例进一步说明本发明，但本发明的保护范围不限于所述内容。
[0017] 实施例1 采取含固率为5%和20%的6L污泥厌氧消化小试试验装置出料沼液和进料剩余污泥作为 实验材料。将上述所有的沼液分别过〇. 22μπι的滤膜去除颗粒物，用1Μ氢氧化钠调节pH至 10.2,取上述沼液各5ml于50ml旋蒸前型瓶中于40摄氏度下抽真空旋转蒸发至干以去掉高 浓度氨氮和挥发性生物胺，用5ml 0.1M盐酸重新溶出，涡旋30s混匀。取上述重新溶出液 200yL于0.5ML 3K Mliipore新型超滤离心管内，13000g离心至所有液体通过，涡旋混匀置 于4°C待用。
[0018] 上述样品经安捷伦HPLC1260自动进样器自动进样程序如下：0.5yL混合0.5yL