一种i-iv型登革热病毒的通用检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种I-IV型登革热病毒的通用检测试剂 盒。
【背景技术】
[0002] 登革病毒(Dengus virus，DENV)登革病毒属于黄病毒科黄病毒属中的一个血清型 亚群，主要通过埃及伊蚊和白纹伊蚊等媒介昆虫传播，引起登革热以及发病率和死亡率很 高的登革出血热和登革休克综合征。世界卫生组织将感染了登革病毒患者的临床症状分类 为登革热(DF)、登革出血热(DH)和登革休克综合征(DSS)。感染患者表现出在持续高热2-7 天，并伴有头痛，全身乏力，恶心，呕吐，肌肉痛和腹痛。近年来，由于全球气候变暖、人口流 动频繁等因素，登革热的爆发和流行范围有逐年扩大和愈演愈烈之势，其在全球的发病率 提高了近30倍。在过去两年中，在地处热带和亚热带地区的东南亚、美洲以及西太平洋地 区，超过100个国家的25亿人受到登革病毒的威胁，在2009-2013年间每年全球登革热、登革 出血热的发病数均达3.9亿。2015年，截止10月10日仅在中国云南省西双版纳州累计报告登 革热病例超过398例。登革热是过去50年间世界上最为严重的传染病之一，已成为严重的全 球性公共卫生问题，不仅严重危害人类的健康，还为国家和个人带来沉重的经济负担。
[0003] 目前由于登革热治疗的特效药物以及相关的预防疫苗还没有上市。所以登革热的 诊断对预防和治疗登革热起到了至关重要的作用。在常规诊断方法主要包括三种，（1)RT-PCR法:登革病毒检测的方法常规用的是分离病毒后，通过RT-PCR来检测；（2)登革病毒抗体 IgM和IgG抗体ELISA检测法；（3)登革病毒NS1抗原的检测法。在这三种检测方法中，RT-PCR 法为最经典的检测方法，但是由于其操作时间长，成本也最高，所以不太适合临床大量样本 的处理和检测。而第二种登革病毒抗体IgM和IgG抗体ELISA检测法，虽然其具有特异性、敏 感性以及稳定性较高的特点，但其只有在登革病毒感染5-7天后才能检测出来。第三种NS1 抗原检测法与第二种方法相比，能在最初感染的时候被检测出来，对于登革热的早发现、早 干预及早治疗具有重要意义。而且NS1抗原的检出浓度对于登革热患者的预后具有重要的 指导意义。但目前的NS1抗原的ELISA检测试剂盒中的包被抗体和检测抗体，其来源大多都 为天然NS1抗体免疫后所得的抗体，由于登革病毒有四个型别，所以其抗体的制作过程会相 对复杂，成本也会相应的有所提高。因此，制作操作简单、早期检测、快速准确且成本低的新 型的登革病毒NS1抗原的ELISA检测试剂盒对于普通人民有着重要的意义。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种基于登革病毒非结构蛋白 NS1特异表位肽的I-IV型登革热病毒的通用检测试剂盒，通过检测血清中登革病毒中的非 结构蛋白NS1，可对早期感染登革热的病人进行早期诊断和最后的确诊，还可以通过检测非 结构蛋白NS1的量来指导病人的病情。
[0005] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
[0006] -种I-IV型登革热病毒的通用检测试剂盒，包括酶标记板、阴性对照血清、阳性对 照重组蛋白、检测抗体、显色底物和终止液；
[0007] 所述酶标记板上的包被抗体为DV14抗体，所述的DV14抗体的氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示；
[0008] 所述的阴性对照血清为没有感染登革热病毒的正常人的血清；
[0009] 所述的阳性对照重组蛋白包括四种型别的NS1重组蛋白；
[0010] 所述的四种型别的NS1重组蛋白的制备方法均是将登革病毒标准株经RT-PCR扩增 后，与PMD19T载体连接，连接产物与pET30a经BamHI和Notl双酶切后，胶回收，T4DNA连接酶 连接回收产物，然后再转到大肠杆菌BL-21中，通过表达纯化，得到相应型别的NS1重组蛋 白；
[0011] 所述的登革病毒标准株包括I-IV型登革病毒标准株；
[0012] 所述的检测抗体为连接了生物素的DV11抗体，所述的DV11抗体的氨基酸序列如 SEQ ID No.2；
[0013] 所述的显色底物包括酶标亲和素抗体和TMB显色液;所述的酶标亲和素抗体为HRP 标记的羊抗小鼠二抗；
[0014] 所述的终止液为2M的硫酸。
[0015]进一步，优选的是所述的DV14抗体的制备方法为:将如SEQ ID No. 1的氨基酸序列 编码的多肽DV14与牛血清蛋白连接后免疫小鼠所得的单克隆抗体。
[0016]进一步，优选的是所述的DV14抗体的制备方法为:将多肽DV14与牛血清蛋白连接 后，得到DV14-BSA抗原；
[0017]用生理盐水将DV14-BSA稀释并与弗氏完全佐剂乳化，至乳化液中DV14-BSA的浓度 为lyg/μL，然后将乳化液于小鼠皮下多点注射，选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，以每只小鼠 免疫1〇〇μ1的的乳化液来免疫，每只小鼠免疫的抗原量为l〇〇yg;然后分别在第21天、第35 天、第49天后用相同的办法进行第二次、第三次以及第四次免疫;经四次免疫过后，取小鼠 脾细胞，按1:4(v/v)的比例将SP2/0骨髓瘤细胞与脾细胞进行混合，总体积20ml，混合前骨 髓瘤细胞和脾细胞的密度均调节为1〇 7个/ml，850rpm离心5min，弃掉上清，然后在37°C水浴 中于1分钟内边摇边滴加 lml的50%(v/v)PEG-1400的GKN溶液，滴加完后于2分钟内再加入 20ml预热至37°C的1640培养基以终止融合，1000r/min离心，去上清，用60ml含10% (v/v)胎 牛血清的1640培养基重悬细胞，并每孔100μ1加入预先加好饲养细胞的96孔板中，于37°C、 5%C0 2培养箱中培养，12h后，把含10% (v/v)胎牛血清的1640培养基换成含有HAT的选择培 养基，同样条件下培养，每隔2天换一次新的HAT选择培养基，待细胞长至39-41 %的时候，把 含有HAT的选择培养基换成含有HT的培养基，通过有限稀释法得到了DV14单克隆细胞株；
[0018] 选取6-8周龄的BALB/c小鼠提前一周用石蜡油来致敏小鼠，注射2ml的106个/ml的 DV14单克隆细胞株来制备腹水，最后采用Millpore公司Montage Antibody purification kit试剂盒来纯化腹水，得到包被抗体DV14。
[0019] 进一步，优选的是所述酶标记板的制备方法是:将所述的包被抗体DV14用包被缓 冲液稀释到2.5μg/ml后，按100μ1/孔包被到酶标记板的微孔内，在4°C条件下，将酶标记板 置于湿盒中反应24小时后，用TOST洗板，每孔TOST用量为0.25ml，在4°C下，按每孔200μ1放 入3%(m/v)的脱脂奶粉封闭酶标记板，封闭24小时后，弃除多余的封闭液，置4°C保存，即得 到酶标记板；
[0020] 所述的包被缓冲液的口11为9.6，每10001111包被缓冲液中含如2(：03 1.598、 NaHC032.93g；
[0021] 所述的PBST为含有0.05% (v/v)吐温20的磷酸缓冲液；
[0022]所述的3%(m/v)的脱脂奶粉为以PBST为溶剂，以脱脂奶粉为溶质配成的溶液。 [0023]进一步，优选的是所述的阳性对照NS1重组蛋白的制备方法为：
[0024]①将登革病毒标准株进行RT-PCR扩增，得到NS1全基因；
[0025] ②将NS 1全基因与pMD 19T载体连接，制备PMD19T-NS1质粒；
[0026] ③将pMD19T-NSl质粒以及空表达载体pET30a同时采用BamHI和Notl进行双酶切， 胶回收NS1目的片段与双酶切后的表达载体pET30a质粒片段，然后采用T4DNA连接酶将胶回 收的NS1目的片段与表达载体pET30a质粒片段进行连接，得到pET30a-NSl质粒；
[0027]④将pET30a-NSl质粒到大肠杆菌BL-21中，然后通过表达纯化，得到NS1重组蛋白； [0028] 所述的登革病毒标准株为I型登革病毒标准株DVIAg.st、Π 型登革病毒标准株DV2 16681、ΙΠ 型登革病毒标准株DV3H87和IV型登革病毒标准株DV4H241;
[0029]所述的RT-PCR扩增时，I型登革病毒标准株DVIAg. st的扩增引物为：
[0030] F：5'-GGATCCGACTCGGGATGTGTAATCAACT-3'(SEQ ID No.3)；
[0031] R：5'-GCGGCCGCTGCAGAGACCATTGACTTAACTAGG-3'(SEQ ID No.4)
[0032] Π 型登革病毒标准株DV2 16681的扩增引物为：
[0033] F：5'-GGATCCGATAGTGGTTGCGTTGTGAGCTGG-3'(SEQ ID No.5)；
[0034] R：5'-GCGGCCGCAGCTGTGACCAAGGAGTTGACC-3'(SEQ ID No.6)；
[0035] ΙΠ 型登革病毒标准株DV3H87的扩增引物为：
[0036] F：5'-GGATCCGACATGGGGTGTGTCATAAACT-3'(SEQ ID No.7)；
[0037] R：5'-GCGGCCGCCGCTGAGACTAAAGACTTTACCATG-3'(SEQ ID No.8)；
[0038] IV型登革病毒标准株DV4H241的扩增引物为：
[0039] F：5'-GGATCCGACATGGGTTGTGTGGCGTCATGGA-3'(SEQ ID No.9)；
[0040] R:5'-GCGGCCGCGGCCGTCACCTGTGATTTGACCA-3'（SEQ ID No.10)。
[0041] 进一步，优选的是所述的检测抗体的制备方法为将生物素与DV11抗体连接所得的 抗体，即为检测抗体；
[0042]检测抗体在进行检测时，将检测抗体（lyg/yl)与溶剂按照体积比为1:3000进行配 制后进行检测，该溶剂为PBS;
[0043]而所用的显色底物中的酶标亲和素抗体在使用时，将酶标亲和素抗体（lyg/yl)与 溶剂按照体积比为1:2000进行配制后进行检测，该溶剂为包被缓冲液；
[0044]所述的DV11抗体的制备方法是将如SEQ ID如.2的氨基酸序列编码的多肽0￥11与 牛血清蛋白连接后免疫小鼠所得的单克隆抗体。
[0045]进一步，优选的是所述的DV11抗体的制备方法是:将多肽DV11与牛血清蛋白连接 后，