一种朱顶红褪绿环斑病毒检测试剂盒及其检测方法与应用
【技术领域】
[0001]本发明属于植物病毒检测技术领域，具体涉及一种朱顶红褪绿环斑病毒检测试剂 盒及其检测方法与应用。
【背景技术】
[0002] 朱顶红裡绿环斑病毒(Hippeastrum chlorotic ringspot virus，HCRV)属于布尼 亚病毒科〇311]15^￥；[1^(^6)番前斑萎病毒属(1'08卩0￥；[1'118)成员，该病毒是2011年于云南朱顶 红上发现的一种Tospovirus新病毒。HCRV在朱顶红上的症状主要表现为叶片坏死和褪绿环 斑，目前仅在朱顶红和蜘蛛兰2个石蒜科植物上发现该病毒侵染，其病害高发时期发病率可 达90%以上。近年来，朱顶红和蜘蛛兰鲜切花的产量和销量呈逐年上升的趋势，由于其具有 较高的观赏价值和较好的市场前景，因此研究并获得一种能快速鉴定该病害的检测方法对 于该病害的防控技术具有重要的意义。
【发明内容】
[0003] 本发明的第一目的在于提供一种朱顶红褪绿环斑病毒检测试剂盒;第二目的在于 提供所述的朱顶红褪绿环斑病毒检测试剂盒的检测方法;第三目的在于提供所述的朱顶红 褪绿环斑病毒检测试剂盒的应用。
[0004] 本发明的第一目的是这样实现的，包括盒体、硝酸纤维素膜、显色液试剂瓶、抗体 试剂瓶、对照试剂瓶； 所述的显色液试剂瓶包括显色试剂瓶A和显色液试剂瓶B; 所述的抗体试剂瓶包括一抗试剂瓶和二抗试剂瓶； 所述的对照试剂瓶包括HCRV标准阳性对照试剂瓶和HCRV标准阴性对照试剂瓶。
[0005] 本发明的第二目的是这样实现的，包括以下步骤： 1)根据检测样品数量剪下硝酸纤维素膜，将硝酸纤维素膜的一角剪去，用以指示膜方 向。
[0006] 2)检测样品加入洗涤缓冲液研磨，移液器取2.5 μL研磨液点至硝酸纤维膜方框 中，同时点上标准阳性对照和标准阴性对照，室温放置或37°C放置至膜彻底干燥； 3) 将膜移至容器，加入封闭缓冲液，室温或37 °C封闭1 h; 4) 在封闭缓冲液中加入一抗，室温摇床摇匀，37°C培育1 h或4°C培育过夜； 5) 弃去一抗培育液，洗涤缓冲液洗膜3次，每次5 min; 6) 弃去洗涤缓冲液，加入封闭缓冲液，再在封闭缓冲液中加入二抗，室温摇床摇匀，37 °C培育1 h或4 °C培育过夜； 7) 弃去二抗培育液，洗涤缓冲液洗膜3次，每次5 min; 8) 弃去洗涤缓冲液，显色缓冲液洗膜1次，每次5 min; 9) 弃去显色缓冲液，加入显色液黑暗处显色，充分显色后将膜移至清水中终止显色，分 析并记录检测结果。
[0007] 本发明的第三目的是这样实现的，所述的朱顶红褪绿环斑病毒检测试剂盒在检测 朱顶红褪绿环斑病毒中的应用。
[0008] 本发明的优点： 通过原核表达的方法制备了一种Tospovirus新种朱顶红褪绿环斑病毒外壳蛋白，免疫 家兔获得该新病毒兔抗血清，优化并组装了朱顶红褪绿环斑病毒dot-ELISA检测试剂盒并 应用于疑似样品的快速检测，该方法可大量、快速、准确地检测朱顶红等植株中该类新 Tospoviruses，为病害防控提供技术保障。
【附图说明】
[0009] 图1为朱顶红植株上HCRV的检测点样图； 图2为朱顶红植株上HCRV的检测检测结果图。
【具体实施方式】
[0010]下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以 限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
[0011] 本发明所述的朱顶红褪绿环斑病毒(Hippeastrum chlorotic ringspot virus， HCRV)检测试剂盒，包括盒体、硝酸纤维素膜、显色液试剂瓶、抗体试剂瓶、对照试剂瓶； 所述的显色液试剂瓶包括显色试剂瓶A和显色液试剂瓶B; 所述的抗体试剂瓶包括一抗试剂瓶和二抗试剂瓶； 所述的对照试剂瓶包括HCRV标准阳性对照试剂瓶和HCRV标准阴性对照试剂瓶。
[0012] 所述的硝酸纤维素膜设有方格，方格中空白处用以点样。
[0013] 所述的显色液试剂瓶A含有NBT显色液;显色液试剂瓶B含有BCIP显色液。
[0014] 所述的NBT显色液是将0.5g NBT溶于10ml 70%的二甲基甲酰胺;BCIP显色液是将 0.5g BCIP溶于10ml 100%的二甲基酰胺。
[0015] 所述的一抗试剂瓶含有朱顶红褪绿环斑病毒特异性多克隆抗体;二抗试剂瓶含有 特异性羊抗兔。
[0016] 所述的含有朱顶红褪绿环斑病毒特异性克隆抗体的制备是采用其N基因原核表达 的方法得到免疫源，免疫家兔获得，使用效价为1:500~20000;朱顶红褪绿环斑病毒N基因 PCR扩增引物根据尹跃艳(Yin. Y. Y.)注册报道的HCRV蜘蛛兰分离物N基因全序列设计(注册 号为:KU356853)，引物序列及其退火温度具体见下表：
所述的HCRV标准阳性对照试剂瓶含有感染HCRV的本氏烟植物干粉;HCRV标准阴性对照 试剂瓶含有健康本氏烟植物干粉。
[0017] 本发明所述的朱顶红褪绿环斑病毒检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤： 1)根据检测样品数量剪下硝酸纤维素膜，将硝酸纤维素膜的一角剪去，用以指示膜方 向。
[0018] 2)检测样品加入洗涤缓冲液研磨，移液器取2.5 μL研磨液点至硝酸纤维膜方框 中，同时点上标准阳性对照和标准阴性对照，室温放置或37°C放置至膜彻底干燥； 3) 将膜移至容器，加入封闭缓冲液，室温或37 °C封闭1 h; 4) 在封闭缓冲液中加入一抗，室温摇床摇匀，37°C培育1 h或4°C培育过夜； 5) 弃去一抗培育液，洗涤缓冲液洗膜3次，每次5 min; 6) 弃去洗涤缓冲液，加入封闭缓冲液，再在封闭缓冲液中加入二抗，室温摇床摇匀，37 °C培育1 h或4 °C培育过夜； 7) 弃去二抗培育液，洗涤缓冲液洗膜3次，每次5 min; 8) 弃去洗涤缓冲液，显色缓冲液洗膜1次，每次5 min; 9) 弃去显色缓冲液，加入显色液黑暗处显色，充分显色后将膜移至清水中终止显色，分 析并记录检测结果。
[0019] 本发明所述的朱顶红褪绿环斑病毒检测试剂盒的应用为所述的朱顶红褪绿环斑 病毒检测试剂盒在检测朱顶红褪绿环斑病毒中的应用。
[0020] 结果分析方法： 标准阳性对照斑点变为红色、紫红色或黑色，标准阴性对照斑点不变色，表明实验过程 正确无误。检测样品斑点变为红色、紫红色或黑色表明该样品带有HCRV，计作阳性样品；检 测样品斑点不变色表明该样品不带有HCRV，计作阴性样品。
[0021 ]洗涤缓冲液配方（1 L):
封闭缓冲液配方： 洗涤缓冲液按质量体积比(W/V)加入5%脱脂奶粉混匀。
[0022] 显色缓冲液配方（100 ml):
显色液配制方法： 每10 ml显色缓冲液中加入66 μL显色液A和33 μL显色液B混匀。
[0023] 显色液A配方:0.5 g NBT溶于10 ml 70%的二甲基甲酰胺。
[0024] 显色液B配方:0.5 g BCIP溶于10 ml 100%的二甲基甲酰胺。
[0025] -抗试剂瓶使用说明：一抗试剂瓶保存在4°C，使用效价为1:3000。
[0026] 二抗试剂瓶使用说明：二抗试剂瓶保存在4°C，使用效价为1:8000。
[0027] 对照试剂瓶使用说明：使用前加入2 ml洗涤缓冲液。
[0028] 本发明所述的朱顶红褪绿环斑病毒检测试剂盒设有盒体、硝酸纤维素膜、显色液 试剂瓶、抗体试剂瓶、对照试剂瓶和检测试剂盒说明书，所述硝酸纤维素膜、显色液试剂瓶、 抗体试剂瓶、对照试剂瓶和检测试剂盒说明书设在盒体内。制备方法：1)制备硝酸纤维素 膜，所述硝酸纤维素膜上划有方格，方格中空白处用以点样;2)制备显色液试剂瓶，所述显 色液试剂瓶包括显色液试剂瓶A和显色液试剂瓶B;3)制备抗体试剂瓶，所述抗体试剂瓶包 括一抗试剂瓶和二抗试剂瓶，所述一抗为朱顶红褪绿环斑病毒特异性多克隆抗体，采用朱 顶红褪绿环斑病毒N基因原核表达的方法得到免疫源，免疫家兔获得，使用效价为1:500~ 20000;所述二抗为特异性羊抗兔;4)制备对照试剂瓶，所述对照试剂瓶包括HCRV标准阳性 对照试剂瓶和HCRV标准阴性对照试剂瓶;5)制备检测试剂盒说明书，所述检测试剂盒说明 书包括检测方法，洗涤缓冲液配方、封闭缓冲液配方、显色缓冲液配方、显色液配制方法、一 抗试剂瓶使用说明、二抗试剂瓶使用说明和对照试剂瓶使用说明。所述朱顶红褪绿环斑病 毒检测试剂盒可在检测朱顶红褪绿环斑病毒中应用。具体包括： A、朱顶红褪绿环斑病毒检测试剂盒:朱顶红褪绿环斑病毒检测试剂盒设有盒体、硝酸 纤维素膜、显色液试剂瓶、抗体试剂瓶、对照试剂瓶和检测试剂盒说明书，所述硝酸纤维素 膜、显色液试剂瓶、抗体试剂瓶、对照试剂瓶和检测试剂盒说明书设在盒体内。
[0029] B、朱顶红褪绿环斑病毒检测试剂盒制备方法： 1) 制备硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜上划有方格，方格中空白处用以点样； 2) 制备显色液试剂瓶，所述显色液试剂瓶包括显色液试剂瓶A和显色液试剂瓶B; 3) 制备抗体试剂瓶，所述抗体试剂