测定游离铜的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种测定血清中"游离"铜（即结构上没有结合到铜蓝蛋白的血清铜部 分）的新方法。本发明还涉及一种高敏感度和精确度的测定患有阿尔茨海默氏病的患者的 血清样品中游离铜的方法。
【背景技术】
[0002] 血清铜的测定在大量疾病中是最重要的，例如在阿尔茨海默氏病(AD)中。阿尔茨 海默氏病是一种神经性疾病，其特点是记忆力减退和进行性痴呆。该疾病出现的原因与β_ 淀粉样(Αβ)蛋白和Tau肽在大脑内的聚集密切相关。而且，载脂蛋白Ε(ΑΡΟΕ)基因的ε4等位 基因已被证明增加阿尔茨海默氏病的风险。关于"淀粉样蛋白级联"，其被公认为阿尔茨海 默氏病发病的最流行假说，最近出现了新的细节。事实上，不同的致病途径已被假定促进阿 尔茨海默氏病的发病和进展。有大量证据证明氧化应激，主要通过金属氧化还原反应，可引 起对阿尔茨海默氏病的大脑的大脑损伤。具体地，已经提出淀粉样蛋白的超金属化可以 基于氧化应激和过氧化氢生产的氧化还原循环，确定Αβ蛋白低聚体的形成和沉淀。金属体 内平衡的紊乱导致游离铜的形成，游离铜的形成可能供给大脑铜储层并进入Αβ氧化应激循 环，产生对阿尔茨海默氏病的多效性。这篇论文现在得到了多方面的证据支持，这些证据显 示游离铜略有增加，但在阿尔茨海默氏病患者的血清中上升显著。
[0003] 铜蓝蛋白是血液中的主要载铜蛋白质，且其在结构上结合6个铜原子以形成蛋白 质的活性形式，该活性形式占循环铜的约85-95%，剩余的铜被定义为游离铜。在先前的研 究中，本发明人常从铜和铜蓝蛋白的测量开始测定血清中的游离铜，计算如下:血清铜浓度 通过用原子吸收光谱技术，该技术利用配备了具有HGA800平台的石墨炉的A Aanalyst 300 Perkin Elmer原子吸收分光光度计，或根据Abe等人Clin Chem 1989(Randox Laboratories，Cruml in，UK)的比色测定法测量进行复核；铜蓝蛋白的浓度通过根据Wolf PL Crit Rev Clin Lab Sci 1982的免疫比池法（Horiba ABX，Montpellier，France)进行 分析，对于每个血清铜和铜蓝蛋白对来说，已经根据Walsh等人Ann Clin Biochem 2003描 述的标准方法计算了结合到铜蓝蛋白上的铜(CB)的量和未结合到铜蓝蛋白上的铜（"游离" 铜）的量。该计算用ymol/L表达"游离"铜并基于铜蓝蛋白包含0.3%的铜的证据。而且，本发 明人最近描述了测量铜蓝蛋白氧化酶活性的方法，该方法采用邻联茴香胺二盐酸盐为底 物。
[0004] 先前，已经描述了从商业标准（Human Serum Ceruloplasmin，Sigma-Aldrich)的 蛋白质氧化酶活性开始测定铜蓝蛋白的量的方法，但是光谱分析显示蛋白质的吸光度峰衰 减，降低了利用酶法检测以量化蛋白质的量的信心，该蛋白质的量对估计游离铜的值来说 是必须的。
[0005] 基于现有技术所描述的酶法对铜和铜蓝蛋白进行定量具有一些缺点，如高成本、 市售铜蓝蛋白的可变纯度、一般建议采用国际单位(UI)报告血清酶以及所测定的浓度准确 度低。
[0006] Hyo Jung Sung等人(J.Am.Chem.Soc.2009)描述了用于测定生物体系中的游离铜 的香豆素探针的合成和使用。
[0007] 本发明的范围是提供用于测量血清中的游离铜的新方法和试剂盒，该新方法和试 剂盒没有现有技术的缺点。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是一种用于在体外测定血清样品中游离铜的浓度的方法，包括以下 步骤：
[0009] (a)将血清样品装载在树脂上进行固相萃取，得到结合级分和包括游离铜的洗脱 级分；
[0010] (b)使用香豆素荧光探针测定在步骤a)中洗脱出的级分中的游离铜的浓度。
[0011] 本发明的另一个目的是用于在体外测定游离铜的浓度以诊断患者的阿尔茨海默 氏病的方法，该方法包括同样的步骤a)、步骤b)和将在步骤b)中测定的值与阈值(截止值） 进行比较的另一步骤c)，其中较高浓度的游离铜确认阿尔茨海默氏病的临床诊断。
[0012] 本发明的另一个目的是用于在体外测定游离铜的浓度以预后患者的阿尔茨海默 氏病的方法，其中在随后的时间点对从患者处收集的血清样品重复方法的步骤a)和步骤 b)，并对这些样品中的游离铜的浓度随时间的进展进行评估。
[0013] 本发明的另一个目的是用于在体外测定游离铜的浓度以评估患有轻度认知功能 障碍的患者从轻度认知功能障碍的状态(MCI)向阿尔茨海默氏病转化的可能性的方法，该 方法包括同样的步骤a)、步骤b)和将在步骤b)中测定的值与阈值(截止值)进行比较的另一 步骤c)，其中较高浓度的游离铜指出从轻度认知功能障碍向阿尔茨海默氏病的转化。
[0014] 本发明的另一个目的是一种用于检测血清中的游离铜的试剂盒，包括一个或多个 对固相进行层析萃取的装置和一个或多个香豆素荧光探针。
[0015] 本发明人观察到由于血蛋白的存在，对血清中的游离铜的浓度估计不准确;而且， 他们还观察到从血蛋白中分离低分子量化学元素的各种方法(例如用膜过滤设备)不能准 确测定游离铜的浓度。在本文中所描述的发明是基于从血蛋白中分离游离铜的步骤的选择 和荧光探针的特殊种类的选择。
[0016] 本发明的方法相比于现有技术的测定方法具有多个优点：
[0017] -能够高精度和准确地测定血清中的游离铜的浓度；
[0018] -允许用非常降低的成本和时间测定血清中游离铜的浓度；
[0019] -这是一个易于自动化的方法。
【附图说明】
[0020] 图 1 ·在Cu++(10-4M)存在下在HEPES:DMS0 9:1 (λ0χ = 43〇ηπι，49Οηπιλ0Μ)中香豆素荧光 探针7-(二乙氨基)-2-氧代-Ν-((吡啶-2-基）甲基)-2Η-色烯-3-甲酰胺的校正曲线。
[0021 ]图2 ·在Cu++(10-5Μ)存在下在HEPES: DMS0 9:1 (λ0Χ = 430nm，49Οηπιλ0Μ)中香豆素荧光 探针7-(二乙氨基)-2-氧代-Ν-((吡啶-2-基）甲基)-2Η-色烯-3-甲酰胺的校正曲线。
[0022]图3.受试者工作特征(R0C)曲线。根据本发明的一个实施例对702个样品进行了分 许。曲线表明采用本发明，阿尔茨海默氏病的诊断能够获得高特异性(80%)和离散敏感性 (60%)〇
[0023] 图4.根据血清游离铜含量预测受阿尔茨海默氏病影响的患者的恶化概率模型(简 易精神状态检查）。圆圈代表患者的游离血清铜的值。线代表简易精神状态检查恶化的预测 概率的模型。这些患者来自具有高于-0.138的Z值，对应于2. Ιμπιο?/L的游离铜值，比游离铜 值低于该含量的那些患者具有增加的恶化概率的当前研究小组。
[0024] 图5.游离铜浓度还能够用于预测抱怨轻度认知功能障碍的受试者的百分比，这些 受试者将发展阿尔茨海默氏病。具有大于1.6μΜ的游离铜浓度的轻度认知功能障碍的受试 者具有较高的转化为阿尔茨海默氏病的百分比。
[0025]图6.根据一个实施例用于实施本发明的方法的装置的照片。
[0026]图7.通过固相萃取分离的血清样品的分光光度分析。分光光度分析能够证实蛋白 质存在于滤液中；越高蛋白质的存在，游离铜就回收率方面的性能就越差，因为这些蛋白质 遮挡铜读取。随着曲线宽度减少，蛋白质成分降低，因此游离铜的回收率提高。
[0027]图8Α和8Β.通过膜过滤分离的血清样品的分光光度分析。
[0028] 图9.描述了多项式和"非参数局部加权散点平滑"（局部加权散点平滑）线性回归 分析，得到依据现有技术的参考测试(计算铜)或依据根据本发明的方法(C4D)测定的未结 合到铜蓝蛋