靶标物质的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及靶标物质的检测方法。
【背景技术】
[0002] 固定有各种生物物质的微粒在医疗诊断、生物科技的研究领域等中得到广泛应 用。其中，研究并提出了由各种材料构成的、具有各种粒径及形态和功能的微粒。其中包括 应用磁性颗粒的技术。具体而言，可以举出使用固定有抗体的磁性颗粒来进行亲和柱层析 的技术。此时，通过利用乳胶珠反复进行离心分离和清洗操作来进行抗原的纯化，因此需要 大量的溶剂。与此相对，若使用磁性颗粒，则能够利用磁铁容易地分离颗粒，所以不需要上 述那样繁杂的操作。即，与没有磁性的乳胶珠相比，具有能够迅速且简便地进行抗原纯化的 优点。并且，由于不需要离心分离及大量溶剂的使用，因而还适合于使用机械的自动化。因 此，近年来，免疫磁性颗粒作为免疫诊断(夹心法)的载体得到频繁使用。
[0003] 为了提高磁性颗粒的分子识别性，优选增大其表面积。从这方面出发，为了使每单 位体积的磁珠的表面积更大，使其粒径更小是有效的。另一方面，若磁性颗粒的粒径达到纳 米级，则颗粒的磁性极端减弱。此外，由于布朗运动对水的影响，利用磁铁进行磁分离变得 极为困难。为了解决该问题，提出了使用在粒径为数十纳米的磁性纳米颗粒的表层固定有 热响应性高分子的物质（参见专利文献1、2)。其中，通过加热使热响应性磁性颗粒凝聚，通 过磁性材料所具有的颜色的变化(透明化)来进行靶标物质的检测。具体而言，在与靶标物 质反应后进行加热，由此经时地监测反应液的吸光度，基于吸光度逐渐减小来判断靶标物 质(样本)的存在。
[0004] 专利文献1:国际公开第2008/001868号小册子
[0005] 专利文献2:日本专利第4518767号说明书
【发明内容】
[0006] 发明所要解决的课题
[0007] 通过上述使用热响应性磁性颗粒的技术，认为确实可弥补颗粒微小化所带来的磁 性降低的影响，其检测灵敏度提高。但是，为了实现更微量的分析、更确实地防止医疗诊断 中的假阴性和假阳性，希望检测灵敏度进一步提高。
[0008] 因此，本发明的目的在于提供在利用了热响应性磁性颗粒的靶标物质的检测中能 够实现高的检测灵敏度的靶标物质的检测方法。
[0009] 用于解决课题的手段
[0010] 上述课题通过下述手段得到了解决。
[0011] [1]-种靶标物质的检测方法，其使包含样本的试验液中含有下述标记颗粒、加热 后照射激发光、通过上述标记颗粒的发光状态来检测上述样本中包含的靶标物质的方法， 该靶标物质的检测方法中，通过上述加热，使上述标记颗粒的凝聚状态发生变化。
[0012] [标记颗粒中，在包含磁性材料和荧光材料的复合颗粒的表面具有热响应性聚合 物，进而具有与靶标物质具有结合性的生物分子]
[0013] [2]如[1]所述的靶标物质的检测方法，其中，在上述加热后，通过在上述试验液中 局部聚集的上述标记颗粒的荧光发光的显现，鉴定为不存在靶标物质；通过未显现出上述 聚集的荧光发光，鉴定为存在靶标物质。
[0014] [3]如[1]或[2]所述的靶标物质的检测方法，其中，在上述试验液中导入分散剂。
[0015] [4]如[1]~[3]中任一项所述的靶标物质的检测方法，其中，上述激发光的波长为 300nm~700nm，上述焚光的波长为350nm~800nm。
[0016] [5]如[1]~[4]中任一项所述的靶标物质的检测方法，其中，上述复合颗粒包含具 有上述磁性材料的相和具有上述荧光材料的相，具有上述荧光材料的相由透明材料所形成 的连续相和荧光材料所形成的分散相构成。
[0017] [6]如[1]~[5]中任一项所述的靶标物质的检测方法，其中，按照跨越处于10°C~ l〇〇°C范围的上述热响应性聚合物的临界溶解温度(CST)的方式来进行上述试验液的加热。
[0018] [7]如[1 ]~[6]中任一项所述的革E1标物质的检测方法，其中，对上述试验液赋予磁 力，使处于凝聚状态的上述标记颗粒聚集到被赋予了磁力的部位。
[0019] [8]如[1]~[7]中任一项所述的靶标物质的检测方法，其中，上述复合颗粒的平均 粒径小于lym。
[0020] [9]如[5]~[8]中任一项所述的靶标物质的检测方法，其中，上述透明材料包含二 氧化硅或聚苯乙烯。
[0021] [10]如[1]~[9]中任一项所述的靶标物质的检测方法，其中，上述磁性材料为磁 铁矿、氧化银、铁氧体、钻铁氧化物、锁铁氧体、碳钢、妈钢、KS钢、稀土类钻磁铁或赤铁矿。
[0022] 本说明书中，所谓"在颗粒的表面具有"，其含义除了包括以直接接触的方式存在 于表面之外，还包括隔着其它材料存在于其表面外侧。
[0023]发明的效果
[0024] 根据本发明的靶标物质的检测方法，在利用了热响应性磁性颗粒的靶标物质的检 测中，可实现高的检测灵敏度。
[0025] 本发明的上述特征和优点以及其它特征和优点可通过下述的记载和附图进一步 明确。
【附图说明】
[0026] 图1是示出本发明的靶标物质的检测方法的示例的说明图。
[0027] 图2是示意性地示出构成标记颗粒的热响应性荧光颗粒的侧视图。
[0028] 图3是示意性地示出热响应性荧光颗粒的由加热引起的凝聚和分散性的变化的侧 视图。
[0029] 图4是示意性地示出荧光标记颗粒的一个实施方式的侧视图。
[0030] 图5是示出荧光标记颗粒与靶标物质和分散剂一起形成连结结构物的状态的说明 图。
【具体实施方式】
[0031] 本发明的靶标物质的检测方法如下:使包含样本的试验液中含有后述特定的标记 颗粒，加热后照射激发光，通过此时产生的上述标记颗粒的荧光发光的状态来进行检测。以 下，以其优选实施方式为中心来对本发明进行说明。
[0032][检测方法]
[0033]图1是示出本发明的靶标物质的检测方法的示例的说明图。本实施方式的检测方 法中，将荧光标记颗粒20、分散剂30和包含靶标物质S的样本进行混合。接着，在热响应性聚 合物发生凝聚的条件下，判定有无热响应性聚合物的分散。此时，对样本照射激发光，通过 其荧光发光进行检测。
[0034] 图1(1)是存在靶标物质S的情况，此时，如后述图5所示，藉由靶标物质S形成连结 结构物1〇〇,其在样本液中分散而不发生凝聚。另一方面，在不存在靶标物质S的情况下（图1 (2 ))，分散剂30和荧光标记颗粒20不连结，荧光标记颗粒20独立地存在于体系内。此时，若 进行加热而使液温为临界溶解温度(CST)以上，则荧光标记颗粒20发生凝聚。本实施方式 中，在反应容器B的右侧面设置有磁铁M。通过该磁力，发生了凝聚而带有强磁性的荧光标记 颗粒20被吸引，聚集到磁铁Μ的附近。另一方面，在以分散性高的连结结构物100的形式存在 于液体中的图1(1)的状态下，该荧光标记颗粒20的凝聚未得到促进，其磁性停留于磁性小 的状态。因此，即使磁铁Μ位于容器Β的侧方，荧光标记颗粒20也不会被吸引至该处，维持分 散状态。
[0035] 本实施方式中，在上述图1的状态下对区分了靶标物质S的有无的反应液(容器Β) 照射激发光。于是，在包含靶标物质S的状态的图1 (1)中，荧光停留于来自各荧光标记颗粒 20的发光的水平，虽然液体整体中多少存在发光，但并没有那么强。另一方面，在不包含靶 标物质S的图1(2)中，若照射激发光，则被加热并被吸引至磁铁附近的处于凝聚状态的荧光 标记颗粒20发出荧光。处于凝聚状态且局部集中的荧光标记颗粒20形成荧光发光，能够以 极其显著的状态检测出其荧光。
[0036] 即，本实施方式中，通过在上述试验液中局部聚集的标记颗粒的荧光发光的显现， 鉴定为不存在靶标物质;通过未显现出上述聚集的荧光发光，鉴定为存在靶标物质。
[0037] 颗粒的凝聚以及在磁铁附近的集聚是在不使用荧光材料相2的以往的热响应性磁 性颗粒的情况下也会产生的现象，由此，可观察到例如橙色的集中的部分。但是，没有凝聚 的分散液也略微带有橙色，在靶标物质的量少时等，有时表现出的差异不太明显。与此相 对，根据本发明，能够通过荧光来检测其差异，因此能够检测出显著的荧光发光的变化。若 以检测灵敏度之差（因靶标物质的有无所产生的吸光度或荧光强度之差)来表示该变化，根 据本发明的优选实施方式，相对于现有品能够提高10倍至数百倍。通过该效果，例如在感染 症领域中，能够进行利用迄今为止的生物化学领域的检查设备难以进行的诊断。但是，本发 明并不由该改善效果的例示来限定解释。
[0038] 进而，在本实施方式中，构成荧光标记颗粒20的荧光材料相2由含有荧光色素(分 散层)2b的二氧化硅(连续相)2a构成。其详细情况如后所述，二氧化硅材料通常比磁性材料 比重小，容易漂浮在水等样本液的介质中。也具有其效果，分散和凝聚状态的变化变得更加 敏锐，进而带来检测灵敏度的提高。
[0039] 本实施方式中，有无分散(图1的（1)、（2))的判定通过激发光的照射和由此产生的 荧光的检测来进行。从通过目视或通用的传感器来检测荧光的观点出发，优选上述激发光 源发出下述波长区域的激发光。作为上述激发光源，可以举出汞灯、卤素灯和氙灯。特别优 选使用由激光二极管或发光二极管照射的激发光。更优选具备用于仅使来自上述激发光源 的特定波长的光透射的滤光器，进而，从通过目视等仅检测荧光的观点出发，进一步优选具 备将上述激发光除去而仅使荧光透射的滤光器。进而，特别优选具备接收荧光的光电倍增 管或CCD检测器，由此还能够检