电化学侧向流动生物测定和生物传感器的制造方法
【技术领域】
[0001]本发明一般涉及生物测定和生物传感器，并且特别涉及电化学侧向流动生物测定和生物传感器。
【背景技术】
[0002]在过去几十年，诊断领域的发展对健康和医学领域发生的改善具有重要的影响。诊断的进步带来各种各样有效且可靠的诊断工具，但诊断工具仍然被认为是昂贵的，即使对于经过培训的人员来说使用起来也很复杂，并且主要在大型医疗中心存在。因此，全世界对开发新型的和改进的诊断和监测工具和技术有持续需要，该工具和技术同时是便携式的，可现场操作，并且对病毒和细菌感染以及肿瘤诊断提供快速、准确、直接、定量、低成本的测试。多年来，技术设备的进步已经导致几种原型生物传感器的发展，从而能够实现简单的、灵敏的、特异性的，和安全的检测系统。然而，继续进行生物测定和生物传感器的研发以带来新的、更好的方法和设备仍然存在巨大潜力。
[0003 ]生物测定和生物传感器是基于特定的分析物与任何识别元件，例如抗体、抗原、DNA、酶、生物受体或适体的特异性识别，该识别元件与其特异性DNA底物、抗原或半抗原结合，得到独有的复合体。抗原通常是高分子量的蛋白质、多糖、脂类和多肽，其可以在不同的免疫测定配置中检测出。也可以检测较小的有机分子(半抗原)，比如，药物、单糖、氨基酸、小肽、磷脂、或甘油三酯，条件是其以化学方法连接至载体蛋白质或其它合成基质。因此，通过免疫系统引起特定抗体产生可以认出几乎任何分析物。然而，如果适体用于检测，而不是抗体的“非三明治”型试验，则小分子(半抗原)不需要结合至载体蛋白质或其它合成基质。
[0004]最近，多类生物检测已应用于临床诊断、环境分析和食品安全评估。其中大多数涉及合成的结合物，该结合物包括放射性的、酶的、荧光的、化学发光的或肉眼可见的金属溶胶标签，以及特别设计的反应室，比如微孔板。尽管这些试验是定量的，比如ELISA，所遵循的协议长并且可能需要花费时间和许多反应步骤完成。其成本相对较高并且程序繁琐，需要昂贵的仪器和训练有素的人员。
[0005]在另一方面，侧向流动免疫测定，也被称为“条带”测试，是几乎任何人能够简单进行，且比传统的实验室为基础的任何试验更迅速地产生结果的广泛测试。可以花费少至几分钟使该条带上的有色线显影。近年来，此诊断方面显著发展，并且最常见和公知是家庭妊娠测试。侧向流动免疫分析拥有很大的诊断优势，事实上，它便宜、操作简单、快速(只需几分钟)，且便于携带。它通常需要很少或不需要样本或试剂制备。该条带非常持久和稳定、保质期长，且通常不需要冷藏。该技术具有广泛的医疗诊断应用，例如，确定怀孕，内脏器官衰竭(例如，心脏发作、肾衰竭或糖尿病)，特定病原体感染或污染。在一些情况下，可以利用该条带测试通过分析血液流中的肿瘤特异性标记物(典型地，特异性抗体)快速检测疾病，比如癌症。
[0006]侧向流动免疫测定的原理依赖于竞争在聚合物或金属微粒上的结合位点。由特异性目标激起的抗体结合到金属纳米颗粒或染色的聚合物颗粒。接着，使用免疫过程将这些颗粒应用于释放垫上以便产生稳定的颗粒储层，释放在基于硝化纤维的膜上。将两行试剂固定在膜上。目标参考物或测试行包括可以特异地结合待识别的目标和其他的结合物，对照为抗抗目标抗体行。释放垫和膜与吸收垫组装在一起。首先，将样本加入吸收垫中，然后将条带搁置几分钟，并且直接用肉眼读取结果，寻找有色行的存在。制造这些试剂盒相对便宜。该试剂盒还具有较长的保质期并且完全是一次性的。因此，该技术理想地适合任何快速诊断。
[0007]侧向流动免疫测定
R.Wilson (2008)在“The use of gold nanoparticles in diagnostics anddetect1n”，Chemical Society Reviews 37(9): 2028-2045 中评述了在最普通的形式中，侧向流动免疫测定由白色多孔膜组成，该白色多孔膜使抗体或抗原行带有条纹，并且与结合至肉眼可见的标记的抗体相互作用。首先参考图1，其展示了现有技术的条带。应该注意，图1涉及现有技术的知识，并且，其仅仅构成参考，以更好地理解本发明。
[0008]根据图1，侧向流动设备(条带)的设计展示了该条带的四个主要部件(样本垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸液芯XTL和CL分别代表测试行和对照行。含有目标分析物分子或实体的流体样本应用于条带的最近端，即，坐落在结合垫的顶部上的样本垫或吸附垫。结合垫含有用抗体涂布的比色金属纳米颗粒，比如，金纳米颗粒(GNP)或聚合物(例如，胶乳)微球，该抗体对目标分析物分子(抗原)具有特异性。样本通过毛细作用经由硝酸纤维素膜迀移。
[0009]疏水硝酸纤维素膜充当基底(固体支撑体)，抗目标分析物抗体固定于底层上，在膜的特定区域中横跨该膜的带中，在该位置，抗目标分析物抗体捕捉该分析物并且结合物作为后者进行迀移。侧向流动免疫测定中必不可少的是流体样本，或含有感兴趣的分析物的提取物迀移通过已经固定了结合分子的条带的不同区域，该结合分子与分析物产生或多或少的特异性的相互作用。
[0010]如图1所示，在该条带上铺设至少两行:测试行(TL)和对照行(CL)，该至少两行都已经用特异性抗体或抗原进行预处理，并且是商用侧向流动条带的标准。对照行可以包括抗原或抗体，该抗原或抗体对结合的抗体具有特异性。通常，TL结合分析物，而CL结合连接至红色，涂布纳米金颗粒的捕获抗体或抗原。这些行通常更靠近吸液芯垫而远离结合垫，以便提高侧向流动免疫测定的整体性能。一些侧向流动试验可具有一条以上的测试行，但附加的每条测试行大大增加了免疫传感器的复杂性，因此，增加了成本。
[0011]在流体样本吸附到样本垫上之后，流体通过毛细作用移动到结合垫中，使标记的结合物颗粒再水合并且允许这些颗粒与所吸附的流体样本混合。标记的结合物与样本中含有的特异性的分析物相互作用，从而引发分子间的相互作用，分子间的相互作用取决于试剂的亲和力和亲合力。然后，标记的结合物开始向测试行迀移，从而捕捉并识别结合的分析物，在该测试行标记的结合物被固定并且产生不同的信号，例如，以有色行的形式，表明该测试是阳性的。过量的试剂移过捕获行和被截留在吸液芯垫中，该吸液芯垫被设计成通过毛细作用抽取穿过膜的样本，从而保持沿所述层析条带的侧向流动。
[0012]尽管侧向流动条带立即取得成功，但其目前的应用留下许多有待改进的地方。在对照行的不同信号可能指示体液适当流过该条带。取决于样本中存在的分析物和进行的免疫测定的类型，在测试行和对照行，或，可替换地，仅在测试行结合有色试剂。因此，结果被解读为在反应基质上存在或不存在捕获的结合物行，并且通过眼睛或使用阅读器读取。不幸地，这些结果是二元的(“是或否”)，并且不提供样本中存在的分析物的任何定量测量。换句话说，侧向流动设备的主要缺点是，其仅能够产生定性或半定量测量，同时只能使用特殊的和另外的仪器，比如，比色计，获得定量选项。
[0013]此外，侧向流动条带受到大量的假阳性结果的困扰。一些侧向流动免疫测定是竞争性试验，其与抗体夹心免疫测定的区别在于结合垫包含已经结合至目标分析物的抗体。如果目标分析物存在于样本中，则其不能与结合物产生复合体，因此，仍然是未标记的。竞争性免疫测定最适合测试小分子，比如，毒素和激素，且不能同时结合一个以上的抗体。例如，如果不存在过量的未标记分析物，检测线中可能出现些微有色行，指示不确定的结果。
[0014]侧向流动免疫测定不能提供定量结果已经促进对这样的新的生物测定和生物传感器的迫切需求:允许在相同的样本内进行定量测量并且使当前侧向流动条带的框架小型化，同时维持快速诊断、长保质期并且使未经训练的人员易于操作。由于侧向流动免疫测定试剂盒和设备的市值估计约为21十亿美元，并且全世界超过200家公司产生了一定范围的测试形式，已经进行了许多尝试以改进这些装置。因此，对定量的、更敏感的，且不显示假阳性结果的新类型的侧向流动试验的研发具有长期需求。
[0015]因此，本发明的目的是解决与现代侧向流动试验和生物传感器相关联的问题，并在相同的平台内进行定量测量。本发明通过将侧向流动技术和电化学方法成功结合在一个试验中和在单个设备中解决这些问题。如下文所述，电化学方法与侧向流动技术的这种集成，产生了用于生物传感器的定量的、快速的和便携式的新型平台。
[0016]1.0jeda 等人(2012),在 “Electrochemical immunosensor for rapid andsensitive determinat1n of estrad1l”， Analytica Chimica Acta 743: 117-124中描述了基于用嫁接的对-氨基苯甲酸对丝网印刷碳电极进行表面修饰，接着共价结合链霉亲和素且固定生物素化抗雌二醇(抗雌二醇生物素)，制备用于雌二醇的电化学免疫传感器。
[0017]US 6，478，938提供一种电化学膜条带生物传感器，该生物传感器结合免疫层析法和电导检测技术。所述生物传感器使用纳米金颗粒测量金属的导电性。金属胶体在电化学信号发生膜垫中产生定量信号。因此，该生物传感器的分析信号是基于纳米金颗粒的金属导电性。
[0018]US 7，300，802涉及一种生物传感器，该生物传感器包括具有上文所述的四个膜垫的常规膜带层析试验系统和供应用于酶的底物溶液的另外的膜。此外，该条带具有两组横向设置的膜垫，并且包括用于吸附竖直流动介质的垫和用于吸附水平流动介质的垫。该生物传感器展示了用于免疫反应和酶促反应的连续的侧向流动过程，并该生物传感器使用HRP酶，以提供分析信号。这是复杂的多步骤测试，其包括免疫检测以及酶促反应，结果是通过丝网印刷电极测定电化学信号。
[0019]US 2004/0106190公开了用于检测测试样本中残留的分析物的存在或其数量的流通型试验设备。该设备包括流体介质，该流体介质与电化学亲合型生物传感器连通。电化学亲合型生物传感器利用检测和校准工作电极，该电极能够产生可测量的检测电流且与亲和试剂，比如氧化还原介质和捕获配体，连通。通过用校准电流校准检测电流确定测试样本内分析物的量。该传感器使用氧化还原酶提供电化学信号。
[0020]Dan Du 等人(201 2 )在 “Integrated Lateral Flow Test Strip withElectrochemical Sensor for Quantificat1n of Phosphorylated Cholinesterase:B1marker of Exposure to Organophosphorus Agents”， Analytical Chem.84: 1380-1385中描述了具有电化学传感器设备的集成的侧向流动免疫测定条带，该电化学传感器设备用于量化对农药(有机磷)和神经毒剂的暴露。该生物传感器是基于抗体的使用以选择性地捕获酶用于进行酶活性试验。连接至便携式电化学分析仪的测试条带用于免疫反应和选择性分离酶和生物样本。该生物传感器测量酶(包括受抑制的和活化的)的总量。
[0021]本发明的新生物传感器(ELFB-电化学侧向流动生物传感器)具有全新的设计，并且可以很容易地应用于各种生物系统