一种荧光损耗方法、显微成像方法及显微成像装置的制造方法
【技术领域】
[0001]本发明属于光学显微技术领域，具体涉及一种实现双近红外波长激励的荧光损耗方法，以及利用上述荧光损耗方法的显微成像方法及显微成像装置。
【背景技术】
[0002]在常规的光学成像过程中，根据阿贝原则，光学系统所能够达到的极限分辨率大小约为入射光波长的一半。为了提高分辨率，科学家们提出了许多种打破衍射极限的方法，统称为超分辨成像方法。其中一种重要方法就是受激福射损耗术(STimulated Emiss1nDepleti0n，STED) JTED显微术中包括激发光束以及经过相位调制后得到的空心光束。STED中，利用受激辐射的方法，用损耗激光对激发光斑外围的荧光强行淬灭回基态，从而达到损耗荧光，提高分辨率的目的。相比较其他的超分辨成像方法，STED不仅可以达到纳米级的分辨率，并且能够实现视频速度的快速成像，因此成为了生物学研究中一种重要的方法。不仅如此，结合双光子激励(Two-Photon EXcited，TPE)方法，TPE-STED方法将激发波长从紫外、可见波段转移到近红外波段，在极大地降低了激光对生物组织损伤的同时，也显著地提高了成像深度。目前TPE-STED技术已经成为了一项在深度组织中实现超分辨成像的重要方法。
[0003]但目前来说，TPE-STED技术在深度组织超分辨成像中仍然面临一定的限制和挑战，主要体现在:(I)损耗激光仍然位于可见光波段，在生物组织中散射严重，在较大的深度中很难达到理想的损耗效果。(2)基于STED原理的损耗光功率较大，会对生物组织造成严重的热损伤。(3)目前常用的STED荧光染料普遍存在光漂白或者光闪烁的问题，达不到足够的光稳定性。不能满足长时间成像时的需要。(4)成像所用的光源为高功率飞秒光源，价格昂贵且光学系统复杂，难以推广。
【发明内容】
[0004]本发明的主要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种荧光损耗方法，该方法突破传统的受激辐射荧光损耗，利用受激吸收的方法，结合稀土掺杂上转换纳米材料中的能量传递离子，实现对上转换纳米材料的荧光进行损耗，可以将荧光损耗波长从可见光波段移至红外波段，从而解决了现有技术中损耗光的散射问题，打破了传统多光子STED的深度限制。
[0005]本发明的另一个目的在于提供一种基于上述荧光损耗方法的显微成像方法，该方法结合了多光子超分辨技术及上转换纳米材料本身的优点，实现了激发波长和损耗波长都位于近红外波段，解决了深度组织超分辨成像中损耗波长散射严重的问题，从而达到在较大深度的成像中也可以实现超分辨成像。
[0006]本发明的另一个目的在于提供一种基于上述显微成像方法的显微成像装置，该装置中的激发光和损耗光都可用连续光激光器，具有成本低的优点。
[0007]本发明的目的通过以下的技术方案实现:一种荧光损耗方法，包括以下步骤:
[0008](I)利用近红外激发光激发稀土掺杂上转换纳米材料产生多光子荧光;所述稀土掺杂上转换纳米材料中的稀土离子按照功能不同分为活化离子、敏化离子和能量传递离子二种；
[0009](2)增加一束近红外损耗激光进行激励，这束近红外损耗激光的波长符合敏化离子中相对应的两个能级的能量间隙，这束近红外损耗激光通过引起受激吸收过程，将敏化离子中某一能级的电子激发到更高能级；
[0010](3)处在更高能级的电子将能量传递到能量传递离子，这部分能量通过转换为荧光或者非辐射跃迀的方式损耗掉，从而实现对应能级所产生的荧光的损耗。
[0011]优选的，所述步骤(I)中，稀土掺杂上转换纳米材料是一种在纳米晶中掺杂稀土离子的复合型纳米材料，所述纳米晶采用NaYF4、NaGdF4、Y203、Zr02等材料，所述稀土离子包括Er3+、Tm3+、Ho3+、Eu3+、Nd3+、Yb3+、Tb3+、Sm3+、Dy3+等镧系元素离子。
[0012]更进一步的，所述稀土离子中活化离子、敏化离子和能量传递离子的具体功能如下:
[0013](I)在第一连续激光器激发下，活化离子吸收单个激发光的光子并将能量传递给敏化离子；
[0014](2)敏化离子吸收一个或多个活化离子传递的能量后发生上转换过程并发射出多光子焚光；
[0015](3)在第二激光器激励下，敏化离子中的部分能量通过受激吸收过程转移到能量传递离子中，并通过转换为荧光或者是非辐射跃迀的方式对能量进行消耗。
[0016]更进一步的，所述步骤(I)中，所述稀土掺杂上转换纳米材料基于稀土离子丰富的实能级，其活化离子通过基态吸收(Ground State Absorpt1n，GSA)对近红外激发光进行吸收后，通过能量传递上转换(Energy Transfer Upconvers1n，ETU)、激发态吸收(EnergyState AbSorpt1n，ESA)将能量传递给敏化离子，再由敏化离子通过上转换过程发射出紫夕卜、可见或是近红外波段的荧光，即激发出多光子荧光。
[0017]优选的，所述近红外激发光与近红外损耗激光的波长波段均位于760nm-2000nm之间。
[0018]一种基于上述荧光损耗方法的显微成像方法，包括以下步骤:
[0019]在一路，第一连续激光器发出一稳定的近红外波长激光，该激光经过准直扩束镜、小孔光阑滤波处理后，获得聚焦的高斯型实心光斑；
[0020]同时在另一路，第二激光器产生稳定的近红外波长激光，该激光经过准直扩束镜、小孔光阑滤波后，再经过空间相位调制板调制形成空心光束，从而获得受激发射损耗光斑；所述近红外波长激光的波长符合敏化离子中相对应的两个能级的能量间隙；
[0021]所述聚焦实心光斑与所述受激发射损耗光斑空间上进行共轴耦合，聚焦实心光斑激发稀土掺杂上转换纳米材料产生多光子荧光，受激发射损耗光斑通过引起受激吸收过程，将敏化离子中某一能级的电子激发到更高能级，处在更高能级的电子将能量传递到能量传递离子，这部分能量通过转换为荧光或者非辐射弛豫过程损耗掉，从而实现对应能级所产生的荧光的损耗；
[0022]收集稀土掺杂上转换纳米材料在上述聚焦光斑作用下发出的荧光，利用光电探测器检测上述超分辨多光子荧光信号，进行XYZ方向扫描，得到荧光成像图片。
[0023]一种基于上述显微成像方法的显微成像装置，包括激发光生成模块、损耗光生成模块、二向色镜、多光子显微扫描模块和光电探测模块，所述激发光生成模块用于生成用作近红外激发光的近红外稳态激光束，所述损耗光生成模块用于生成用作近红外损耗激光的近红外空心光束;所述二向色镜的临界波长选择由所使用的损耗光与激发光波长决定，与近红外稳态激光束成45°角放置，放置在垂直于近红外稳态激光束且穿过该二向色镜的光轴上，近红外稳态激光束通过二向色镜后偏转90°角；重叠的近红外空心光束与近红外稳态激光束在空间上共轭耦合成一束耦合激光束，该耦合激光束通过多光子显微扫描模块聚焦在载物台上标记了稀土掺杂上转换纳米材料的样品上;光电探测模块用于检测上述样品被激发的超分辨多光子荧光信号。
[0024]具体的，所述激发光生成模块包