一种快速检测农作物中咪唑乙烟酸含量的试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及酶联免疫检测技术领域，特别是检测咪唑乙烟酸的酶联免疫试剂盒。
【背景技术】
[0002]咪唑乙烟酸为咪唑啉酮类除草剂，是侧链氨基酸合成抑制剂，对大豆田和其他豆科植物田的禾本科杂草和某些阔叶杂草有优异的防效。目前，咪唑乙烟酸的测定方法主要有高效液相色谱法、气相色谱法等，其检测结果准确可靠，但仪器设备比较昂贵，且样本前处理过程相对复杂。酶联免疫吸附法是一种准确、可靠、快速、特异的检测方法，适合于大批样品的快速筛选，近年来已广泛应用于农产品安全检测行业。本发明旨在建立一种检测咪唑乙烟酸的酶联免疫试剂盒及其检测方法。
【发明内容】
[0003]为了克服色谱法的不足，本发明提供一种检测咪唑乙烟酸的酶联免疫试剂盒及其检测方法。该方法灵敏、准确、快速，操作简便、特异性强，适用于大批样品的快速检测。
[0004]本发明检测咪唑乙烟酸的酶联免疫试剂盒，包括咪唑乙烟酸酶标板、咪唑乙烟酸标准品、咪唑乙烟酸抗体工作液、咪唑乙烟酸酶标二抗工作液、底物液A、底物液B、终止液、浓缩稀释液和浓缩洗涤液。
[0005]本发明检测咪唑乙烟酸的酶联免疫试剂盒的制备，包括以下步骤:酶标板的制备、咪唑乙烟酸标准品的制备、咪唑乙烟酸抗体工作液的制备、咪唑乙烟酸酶标二抗工作液的制备、底物液A的制备、底物液B的制备、终止液的制备、浓缩稀释液的制备和浓缩洗涤液的制备。
[0006]咪唑乙烟酸包被抗原是将咪唑乙烟酸半抗原与载体蛋白偶联得到的，该载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA);用0.05 mol/L pH 9.6的碳酸盐(CBS)缓冲液作为包被液，将咪唑乙烟酸抗原稀释成1:20000比例，10yL /孔，37°C放置2 h，取出酶标板甩掉板内液体，用稀释后的浓缩洗涤液300 μ L/孔，洗板2次，30 s/次；然后加入0.5%牛血清白蛋白(BSA)封闭，150yL /孔，37°C放置1.5 h，弃去封闭液，拍干后的酶标板放置恒温间(25°C)晾干；抽检合格后将酶标板真空密封后置4°C下保存。
[0007]咪唑乙烟酸标准品浓度分别为O ng/mL、0.5 ng/mL、1.5 ng/mL、4.5 ng/mL、13.5ng/mL、40.5ng/mL。
[0008]咪唑乙烟酸抗体工作液是采用咪唑乙烟酸人工抗原免疫小鼠得到单克隆抗体，用抗体稀释液稀释成1:50000比例制备。
[0009]咪唑乙烟酸酶标二抗工作液用酶标二抗稀释液稀释成1:5000比例；底物液A为含有0.5 mmol/L的过氧化氢脲的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液；底物液B为四甲基联苯二胺的乙醇溶液；终止液为2 mol/L的硫酸；浓缩洗涤液是10倍浓缩洗涤液，其包含0.5%吐温-20，0.01 mol/L 的 PBST，pH 值范围 7.0-7.5 之间。
[0010]咪唑乙烟酸的ELISA试剂盒的检测方法包括以下步骤: (1)预处理待测样品，即将待测试的样品处理为液体样品，或者用有机溶剂提取待测样品，并将其复溶于样品稀释液工作液中；
(2)将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温(20?25°C)平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀；
(3)取包被有咪唑乙烟酸抗原的酶标板，加标准品/样本50μ L /孔到对应的微孔中；
(4)加入咪唑乙烟酸酶标二抗工作液，50μ L /孔，然后加入咪唑乙烟酸抗体工作液，50μ L /孔,轻轻振荡混匀,用盖板膜盖板后置室温25°C避光环境中反应30 min ；
(5)小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液250μL /孔，充分洗涤4~5次，每次间隔10 S，用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破)；
(6)加入底物液A50 μ L /孔,底物液B 50 μ L /孔,轻轻振荡混匀,用盖板膜盖板后置25 °C避光环境中反应15min ；
(7)加入终止液50μ L /孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450 nm处或双波长450/630nm检测，测定每孔吸光度值(请在5 min内读完数据)；
(8)以标准品测试的吸光度值与标准品的浓度对数值绘制标准曲线，对照标准曲线计算样品中咪唑乙烟酸的含量。
[0011]待测样品用以下方法进行预处理:
(1)配制乙腈-水溶液(体积比为1:1);
(2)研磨代表性样品(使50%的样品可以通过一个20目的滤网)；
(3)称量20g研磨过滤后的样品加入40 mL乙腈-水溶液，样品稀释比为1:2(w/v)；
(4)在密封的容器里混合，震荡涡旋Imin ；
(5)室温离心4000r/min以上，1min;取Iml上清液到离心管中，50 ~60 °〇水浴氮气吹干；
(6)加入ImL稀释后的样品稀释液充分振荡混合30 S，混匀待测。
【附图说明】
[0012]图1为咪唑乙烟酸的标准曲线。
【具体实施方式】
[0013]咪唑乙烟酸蛋白质偶联物的制备:
采用琥珀酸酐法得到带羧基的咪唑乙烟酸半抗原衍生物，之后取0.05 mmol与载体蛋白BSA按10:1的结合比混合在0.05 mol/L pH 9.6的碳酸盐缓冲液(CBS)中，然后加入
0.15 mmol碳二亚胺，搅拌置室温反应24 h，最后于0.2 mol/L pH 7.6的PBS缓冲液中透析两天，除去未反应的半抗原，将得到的蛋白质偶联物溶液于_20°C保存备用。
[0014]咪唑乙烟酸抗体的制备:
选用健康成年纯种BALA/C小鼠，取与蛋白质偶联制备的免疫抗原50μ g与等量完全弗氏佐剂混合采用腹腔注射进行初次免疫，之后每隔3周用相同剂量免疫抗原加等量不完全弗氏佐剂采用腹腔注射进行二次、三次免疫，每次免疫6天后尾静脉采血测定抗血清效价至一定滴度后，用相同剂量不加佐剂进行末次免疫，3天后取脾制备脾细胞悬浮液与骨髓瘤细胞进行细胞融合，筛选出所需要的杂交瘤细胞系进行克隆化，选择处于对数生长期的杂交瘤细胞进行冻存，用于腹水制备，先腹腔注射0.5 mL液体石蜡于BALB/C鼠致敏，2周后腹腔注射IXlO6个杂交瘤细胞，接种细胞7-10天后可产生腹水，待腹水尽可能多时用注射器抽取腹水，反复收集数次，4000 rpm离心15 min,收集上清，采用辛酸-硫酸铵法纯化腹水对单克隆抗体进行纯化，冷冻干燥得冻干粉后于-20 °C保存备用。
[0015]制备包被有咪唑乙烟酸包被抗原的酶标板:
咪唑乙烟酸包被抗原是将咪唑乙烟酸半抗原与载体蛋白偶联得到的，该载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA);用0.05 mol/L pH 9.6的碳酸盐(CBS)缓冲液作为包被液，将咪唑乙烟酸抗原稀释成1:20000比例，10yL /孔，37°C放置2 h，取出酶标板甩掉板内液体，用稀释后的浓缩洗涤液300yL /孔，洗板2次，30 s/次；然后加入0.5%牛血清白蛋白(BSA)封闭，150 μ L /孔，37°〇放置1.5 h，弃去封闭液，拍干后的酶标板放置恒温间(25°C)晾干；抽检合格后将酶标板真空密封后置4°C下保存。
[0016]咪唑乙烟酸标准品配制浓度分别为O ng/mL、0.5 ng/mL>1.5 ng/mL、4.5 ng/mL、
13.5ng/mL、40.5ng/mL。
[0017]咪唑乙烟酸抗体工作液是采用咪唑乙烟酸人工抗原免疫小鼠得到单克隆抗体，用抗体稀释液稀释成1:50000比例制备。
[0018]咪唑乙烟酸酶标二抗工作液用酶标二抗稀释液稀释成1:5000比例；底物液A为含有0.5 mmol/L的过氧化氢脲的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液；底物液B为四甲基联苯二胺的乙醇溶液；终止液为2 mol/L的硫酸；浓缩洗涤液是10倍浓缩洗涤液，其包含0.5%吐温-20，0.01 mol/L 的 PBST，pH 值范围 7.0-7.5