一种免疫荧光层析法检测肝素结合蛋白用试剂盒及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医疗用品技术领域，尤其涉及生物和医学检测用医疗用品技术领域， 具体涉及一种免疫荧光层析法检测肝素结合蛋白用试剂盒及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 感染性疾病是一类对健康威胁比较严重的疾病，脓毒症和一些严重的感染性疾病 已成为发病和死亡的主要原因。测定感染最常用的传统指标有:降钙素原、C反应蛋白、白细 胞计数、中性粒细胞比、血沉、体温等，但这些指标都不同程度的存在滞后、敏感度低、特异 性不高的缺陷。在感染性疾病的预防和治疗中，如果能及早准确的诊断，就可以及早的采取 合理的应对措施，进而提高感染性疾病的治疗成功率。
[0003] 肝素结合蛋白（heparin-binding protein,HBP)是中性粒细胞来源的颗粒蛋白， 是一个包含222个氨基酸的单链蛋白，当有细菌感染发生时，部分细菌侵入到血管中，细菌 本身或细菌释放的毒素刺激中性粒细胞释放HBP，从而导致血中HBP含量升高。HBP与其它传 统指标相比，除具有灵敏度高、特异性强、阳性/阴性检出率高之外，还具有出现早，只在急 性细菌感染时浓度极度升高，而在病毒感染和非特异性炎症时保持较低的水平。因此，HBP 作为临床新的炎症标志物，具有早期、高特异性、高灵敏度的特点，明显优于传统的标志物， 在临床应用具有对病情的早期评估，预后评价，疗效观察等价值，同时可以指导抗生素的应 用，减少抗生素的滥用，减少耐药菌的发生。因此，研究开发出一种快速、特异、敏感、准确的 测定肝素结合蛋白的浓度，具有重大的临床应用价值和经济意义。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种免疫荧光层析法检测肝素结合蛋白用试剂盒，该试剂盒 能够快速、特异、灵敏、准确地测定肝素结合蛋白。
[0005] 同时，本发明的目的还在于提供一种免疫荧光层析法检测肝素结合蛋白用试剂盒 的制备方法。
[0006] 为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：
[0007] -种免疫荧光层析法检测肝素结合蛋白用试剂盒，包括第一缓冲液、第二缓冲液 和试剂卡；
[0008] 所述第一缓冲液为含有0.83~2ngAil兔抗人肝素结合蛋白抗体的磷酸盐缓冲液； 所述第二缓冲液为含有〇. 05~0.2yg/yl荧光标记的鸡抗兔二抗的磷酸盐缓冲液；
[0009]所述试剂卡包括试纸条，所述试纸条包括塑料垫板，塑料垫板上设置硝酸纤维素 膜，硝酸纤维素膜上左右间隔设置检测线和质控线，检测线左侧硝酸纤维素膜上设置玻璃 纤维素膜，质控线右侧硝酸纤维素膜上设置吸水纸，玻璃纤维素膜上设置滤血膜;所述检测 线上包被鼠抗人肝素结合蛋白抗体;所述质控线上包被羊抗兔抗体。
[0010]所述试剂卡还包括外壳，所述外壳包括连接在一起的上盖和下盖，所述上盖上设 置有血样孔和检测窗;所述血样孔的位置对应滤血膜的位置;所述检测窗的位置对应检测 线和质控线的位置，使检测线和质控线处在检测窗中。
[0011]所述检测线上鼠抗人肝素结合蛋白抗体的包被量为0.2~0.8yg/cm。
[0012]所述质控线上羊抗兔抗体的包被量为0.5~1.4yg/cm。
[0013] 所述荧光标记的鸡抗兔二抗为异硫氰酸荧光素标记的鸡抗兔二抗。
[0014] 所述检测线和质控线之间的间隔距离为5mm~10mm。
[0015] 所述试纸条的宽度为3mm~6mm。
[001 ?] 所述磷酸盐缓冲液的pH=6.5~7.3，磷酸盐浓度为30~80mmol/L。
[0017] 所述试剂盒的使用方法包括以下操作步骤：
[0018] I:取不同浓度的肝素结合蛋白标准品加入到第一缓冲液中，然后再加入第二缓冲 液，混合均匀后加入到试剂卡的滤血膜上，室温水平放置10~15min后，将试剂卡插入荧光 免疫读数仪，设定激发光波长为494nm，发射光波长为518nm，读取不同浓度肝素结合蛋白标 准品的荧光值，并将荧光值与肝素结合蛋白的标准品的浓度值进行线性分析，绘制荧光值 和肝素结合蛋白浓度标准曲线，得到荧光值和肝素结合蛋白浓度关系式；
[0019] Π :取待测样品加入到第一缓冲液中，然后再加入第二缓冲液，混合均匀，加入到 试剂卡的滤血膜上，室温水平放置10~15min，将试剂卡插入荧光免疫读数仪，设定激发光 波长为494nm，发射光波长为518nm，读取待测样品的荧光值，将该荧光值带入步骤I得到的 关系式中，计算得到待测样品肝素结合蛋白的浓度。
[0020] 所述试剂盒储存在4~8°C环境下，在使用时首先将第一缓冲液在室温下平衡15分 钟后再使用。
[0021] 上述免疫荧光层析法检测肝素结合蛋白用试剂盒的制备方法，包括以下操作步 骤：
[0022] 1)制备第一缓冲液:取兔抗人肝素结合蛋白抗体加入磷酸盐缓冲液中，混合均匀， 即得第一缓冲液；
[0023] 2)制备第二缓冲液:取荧光标记的鸡抗兔二抗加入磷酸盐缓冲液中，混合均匀，即 得第一缓冲液；
[0024] 3)制备试剂卡:取硝酸纤维素膜，标记出检测线和质控线，然后在检测线上喷点包 被鼠抗人肝素结合蛋白抗体，在质控线上喷点包被羊抗兔抗体，然后将硝酸纤维素膜、玻璃 纤维素膜、吸水纸、滤血膜依次搭接在塑料垫板上，并切割成所需宽度的试剂卡；
[0025] 4)将步骤1)制备的第一缓冲液、步骤2)制备的第二缓冲液、步骤3)制备的试剂卡， 组装，即得所述的免疫荧光层析法检测肝素结合蛋白用试剂盒。
[0026] 本发明免疫荧光层析法检测肝素结合蛋白用试剂盒，第一缓冲液中包括兔抗人肝 素结合蛋白抗体，第二缓冲液中包括荧光标记的鸡抗兔二抗，试剂卡检测线上包被鼠抗人 肝素结合蛋白抗体，采用荧光免疫层析抗体夹心法的原理实现对血清中肝素结合蛋白浓度 的检测。该试剂盒检测肝素结合蛋白具有好的线性范围，线性范围为1~200yg/L，线性相关 系数R 2 0.990，阳性预测值范围2 1 lyg/L;具有好的重复性，标准品重复测试所得结果的变 异系数CV < 8% ;具有好的准确度，标准品重复测试结果的相对标准偏差< 10%。
[0027] 本发明免疫荧光层析法检测肝素结合蛋白用试剂盒的制备方法，操作简便，易于 控制，适于工业化推广应用。
【附图说明】：
[0028] 图1为本发明实施例1提供的免疫荧光层析法检测肝素结合蛋白用试剂盒中的试 剂卡结构示意图；
[0029] 图2为本发明实施例1提供的免疫荧光层析法检测肝素结合蛋白用试剂盒外壳结 构示意图。
【具体实施方式】
[0030] 下面通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
[0031 ]下述实施例中兔抗人肝素结合蛋白抗体购自Abnova，商品名为H00000566-K;异硫 氰酸荧光素标记的鸡抗兔二抗购自Abnova，商品名为PAB29109;鼠抗人肝素结合蛋白抗体 购自Abno va，商品名为H00000566-B01P;肝素结合蛋白标准品购自Abno va。
[0032] 实施例1
[0033] -种免疫荧光层析法检测肝素结合蛋白用试剂盒，包括第一缓冲液、第二缓冲液 和试剂卡；
[0034]所述第一缓冲液为含有1.5ngAU兔抗人肝素结合蛋白抗体的磷酸盐缓冲液;所述 第二缓冲液为含有〇.12ygAU异硫氰酸荧光素