一种检测肿瘤标志物dkk1 浓度的酶联免疫试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及肿瘤诊断技术领域，特别涉及一种检测肿瘤标志物DKK1浓度的酶联 免疫试剂盒。
【背景技术】
[0002] 在全世界范围内，肝细胞癌（HCC)是第六种最常见的恶性疾病和第二种与癌症相 关的死因。而我国的肝细胞癌高风险人群，包括各种肝炎病毒长期携带者和肝硬化患者，高 达1. 5亿。肝细胞癌的5年总生存率仅为3-5 %，这个极低的生存率的部分原因是因为缺乏 一种及时和有效的诊断，导致在确诊肝细胞癌时已经有60-70%的患者错过了最佳治疗时 机。
[0003] 上海市肿瘤研究所发现的血清蛋白DKK1，是一个比现有肝细胞癌诊断标志物甲胎 蛋白AFP性能更优秀的标志物。该所的研究结果显示，DKK1蛋白对肝细胞癌总体诊断的 灵敏度为69. 1%，特异度为90. 6% ;特别是对早期肝细胞癌和小肝癌的诊断灵敏度分别为 70. 9%和58. 5%，特异性分别为90. 5%和84. 7%。另外，DKK1蛋白能够弥补AFP对肝细胞 癌诊断能力的不足，对甲胎蛋白阴性肝细胞癌的诊断灵敏度为70. 4%、特异度为90%。同 时，DKK1蛋白与AFP联合应用，可将肝细胞癌总体诊断率提高至88%。因此迫切需要发展 一种能够快速、准确和相对廉价地检测DKK1蛋白的方法和产品，以便大规模地对肝细胞癌 进行普查，尽早诊断，提高患者的生存率和全民身体健康。
[0004] 对血清中DKK1浓度的检测主要采用针对DKK1的抗体，利用抗原-抗体的特异性 反应，再加上特定的显色基团对反应量进行测量。而不同的显色基团和抗原-抗体反应的 载体决定了每种检测方法的优缺点。目前国内并没有一种能够高灵敏、高特异和相对廉价 地检测血清DKK1蛋白的方法和试剂盒。中国专利CN101398433公布了一种基于时间分辨 荧光免疫分析方法的试剂盒，该方法需要用到大多数医院并不配备的时间分辨荧光免疫分 析仪，并且该方法还需要用到较为昂贵的荧光标记物，不利于对DKK1的大规模普查。中国 专利CN102507951公布了一种联合检测肿瘤标志物的酶联免疫检测试剂盒，由包被有神经 元特异性烯醇化物酶（NSE)、细胞角蛋白片段21-1(CYFRA21-1)和Dkkopf 1(DKK1)单克 隆抗体的多孔板，辣根过氧化物酶标的NSE、CYFRA21-1和DKK1，显色底物TMB和底物终止 液组成；所述多孔板每孔包被NSE单克隆抗体l-4ug/ml ;每孔包被CYFRA21-1单克隆抗体 l-2ug/ml ;每孔包被DKK1单克隆抗体l-2ug/ml ;NSE、CYFRA21-1、DKK1三种检测性抗体按 4:4:2比例加入多孔板孔中，总体积为lOOul ;该发明公布的试剂盒虽然可以同时检测两种 或三种肿瘤相关抗原，但由于分散了每种抗原的检测精度及灵敏性，且针对DKK1抗原的检 测仅采用了一种DKK1抗体，因而针对DKK1抗原的检测精度难以满足对肿瘤的快速、准确的 检测。此外，国外虽然有检测DKK1蛋白的酶联免疫试剂盒（货号DKK100, R&D Systems公 司，美国），但是其价格昂贵（~Y6000/试剂盒），不利于我国众多肝细胞癌高风险人群对 DKK1大规模普查的需求。
【发明内容】
[0005] 为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种检测肿瘤标志物DKK1浓度的 酶联免疫试剂盒，以匹配自动分析系统实现快速、准确和相对廉价地用于大规模临床检验 肿瘤标志物DKK1。
[0006] 本发明的另一目的在于提供一种检测肿瘤标志物DKK1浓度的酶联免疫试剂盒的 制备方法及应用。
[0007] 为达到上述目的，本发明的技术方案如下：
[0008] -种检测肿瘤标志物DKK1浓度的酶联免疫试剂盒，由包被有DKK1单克隆抗体1 的多孔板、酶标记的DKK1单克隆抗体2、显色底物和底物终止液组成；其中，DKK1单克隆抗 体1为10C3 ;DKK1单克隆抗体2为6E8 ;此处基于双抗体夹心法的原理，包被抗体和检测抗 体选用不同抗体。本发明总共测试了 8个不同的DKK1单克隆抗体，每两两配对为包被抗体 和检测抗体，然后根据每组配对的灵敏性和特异性，选定我司与上海锐劲生物技术有限公 司合作生产的灵敏性和特异性均优的10C3和6E8分别为包被抗体和检测抗体。
[0009] 其中，所述酶标记的DKK1单克隆抗体2的保护液由pH = 7. 2的10mM磷酸盐缓冲 液、0. 5%的牛血清白蛋白、0. 01 %的硫柳汞和50%甘油组成。
[0010] 其中，所述酶标记的DKK1单克隆抗体2的存贮条件为-20°C，且浓度大于100ug/ ml〇
[0011] 其中，所述酶标记的DKK1单克隆抗体2的工作浓度稀释倍数为1:100-1:2500,优 选 1 :400。
[0012] 其中，所述酶标记的DKK1单克隆抗体2所采用的酶为辣根过氧化物酶（HRP)，但不 仅限于HRP，以满足优异的酶标记效果为佳。
[0013] 基于上述结构的酶联免疫试剂盒，本发明又提供了一种用于上述检测肿瘤标志物 DKK1浓度的酶联免疫试剂盒的制备方法，包括如下步骤：①制备包被有DKK1单克隆抗体1 的多孔板：用pH = 7-8的磷酸缓冲液将DKK1单克隆抗体1稀释，然后将稀释后的DKK1单克 隆抗体1溶液加入到多孔板的孔中，37°C孵育2小时；包被后用磷酸盐缓冲液洗板拍干；用 5%牛血清白蛋白溶液加入到多孔板各孔，37°C封闭1小时；封闭后用磷酸盐缓冲液洗板拍 干，将其保存于4°C。②制备酶标记的DKK1单克隆抗体2 :将5mg/ml的HRP (辣根过氧化物 酶）加入0. 2ml的0. 1M高碘酸钠 NaI04溶液中，室温避光搅拌20分钟；将上述溶液对ImM pH4. 4的醋酸钠缓冲液4°C透析过夜；透析后，加20 μ 1 0. 2M pH9. 5的碳酸盐缓冲液，然后 立即加入10mg DKK1单克隆抗体2,室温避光搅拌2小时；加入0. lml新配的4mg/ml NaBH4 溶液，混匀，4°C放置2小时；将上述溶液对10mM pH7. 2PBS缓冲液4°C透析过夜；在搅拌下 逐滴加入等体积饱和硫酸铵，4°C放置1小时；3000rpm离心半小时，弃上清；沉淀物用半饱 和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量10mM PH7. 2的PBS中；将上述溶液对酶标抗体保护 液4°C透析过夜，lOOOOrpm离心30分钟去除沉淀后分装冷冻保存。
[0014] 通过上述技术方案，本发明提供的一种检测肿瘤标志物DKK1浓度的酶联免疫试 剂盒，采用全国产化的试剂，包括优质的DKK1单克隆抗体1及DKK1单克隆抗体2 (两种抗体 均采购至上海锐劲生物技术有限公司，其中DKK1单克隆抗体1的型号为10C3，DKK1单克隆 抗体2的型号为6E8)，制造了与大多数医院现有仪器相匹配的酶联免疫试剂盒，实现了对 DKK1浓度极高灵敏、高特异和相对廉价的检测，有利于大规模地对肝细胞癌进行普查，尽早 诊断，提高我国全民身体健康。
【附图说明】
[0015] 为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使 用的附图作简单地介绍。
[0016] 图1为本发明实施例所公开的酶联免疫法检测DKK1的原理示意图；
[0017] 图2为本发明实施例所公开的本发明与进口试剂盒的相关性示意图。
【具体实施方式】
[0018] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完 整地描述。
[0019] 本发明中的抗体来源说明：作为包被抗体的DKK1单克隆抗体1为采购至上海锐劲 生物技术有限公司的型号为10C3的抗体，DKK1单克隆抗体2为采购至上海锐劲生物技术 有限公司的型号为6E8的抗体。
[0020] 实施例1 :
[0021] 基于图1所示的酶联免疫法检测DKK1的原理示意图，本发明提供了一种检测肿 瘤标志物DKK1浓度的酶联免疫试剂盒，由包被有DKK1单克隆抗体1的多孔板、酶标记的 DKK1单克隆抗体2、显色底物（TMB)和底物终止液组成；其中，DKK1单克隆抗体1为10C3 ; DKK1单克隆抗体2为6E8 ;其中，所述酶标记的