基于核酸适体荧光探针afp4的甲胎蛋白试剂盒及其检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于医学检验测定技术领域，特别是涉及基于核酸适体荧光探针AFP4的甲 胎蛋白试剂盒及其检测方法。
【背景技术】
[0002] 甲胎蛋白（AFP)是一种糖蛋白，正常情况下，这种蛋白主要来自胚胎的肝细胞，胎 儿出生后约两周甲胎蛋白从血液中消失，因此正常人血清中甲胎蛋白的含量尚不到20微 克/升。甲胎蛋白在产妇羊水或母体血浆中AFP可用于胎儿产前监测。如在神经管缺损、脊柱 裂、无脑儿等时，AFP可由开放的神经管进入羊水而导致其在羊水中含量显著升高。胎儿在 宫腔内死亡、畸胎瘤等先天缺陷亦可有羊水中AFP增高。AFP可经羊水部分进入母体血循环。 在85%脊柱裂及无脑儿的母体，血浆AFP在妊娠16-18周可见升高而有诊断价值，但必须与临 床经验结合，以免出现假阳性的错误。
[0003] 检测甲胎蛋白的方法有好几种，放射免疫法测得的甲胎蛋白大于甲胎蛋白500 微克/升、且持续4周者，或甲胎蛋白在200~500微克/升、持续8周者，在排除其它引起甲胎 蛋白增高的因素如急、慢性肝炎、肝炎后肝硬化、胚胎瘤、消化道癌症后，需再结合定位检 查，如B超、CT、磁共振(MRI)和肝血管造影等即可作出诊断。不过，正常怀孕的妇女、少数肝 炎和肝硬化、生殖腺恶性肿瘤等情况下甲胎蛋白也会升高，但升高的幅度不如肝癌那样高。 肝硬化病人血清甲胎蛋白浓度多在25~200微克/升之间，一般在2个月内随病情的好转而 下降，多数不会超过2个月；同时伴有转氨酶升高，当转氨酶下降后甲胎蛋白也随之下降，血 清甲胎蛋白浓度常与转氨酶呈平行关系。如果甲胎蛋白浓度在500微克/升以上，虽有转 氨酶升高，但肝癌的可能性大，转氨酶下降或稳定，而甲胎蛋白上升，也应高度怀疑肝癌。
[0004] 甲胎蛋白在肝癌出现症状之前的8个月就已经升高，此时大多数肝癌病人仍无明 显症状，肿瘤也较小，这部分患者经过手术治疗后，预后可得到明显改善，故肝硬化、慢性肝 炎病人、家族中有肝癌患者的人应半年检测一次。
[0005] 目前没有能够直接识别甲胎蛋白的抗体和其它分子探针。因此设计一种高度设别 甲胎蛋白的分子探针，并基于此建立简单快速和廉价的检测方法将提高对肝癌和胎儿先天 病等于甲胎蛋白相关的疾病的的监控。
[0006] 核酸适配体是近年发展起来的一类新型识别分，是指能够高特异性和高亲和力地 域靶分子结的单链核苷酸分子。核酸适体可以通过配体指数富集系统进化技术 (Systematic Evolution of Ligands by ExponentialEnrichment，SELEX)筛选获得。 SELEX技术是指应用化学法合成大容量的随机寡核苷酸（由两端的固定序列和中间的随机 序列组成）文库，通过施加选择压力（结合靶目标，淘选与靶目标高度特异结合片段的过 程），并结合体外扩增技术，经过多轮的循环选择富集，获得与靶物质高度特异结合的寡 核苷酸分子，可以是RNA也可以是DNA，长度一般为25~60个核苷酸。核酸适体主要通过 发生适应性折叠，通过氢键、疏水堆积作用、范德华力与靶分子相互作用，与插入或包被的 革巴分子形成稳定的三维空间结构。核酸适体不与祀分子结合时，核酸适体处于比较松散的 结构，5'和3'两端相互游离。与靶分子结合时，靶分子诱导核酸适体结构发生改变，核酸 适体的5'端和3'端都将参与与靶分子特定区域(类似于与抗体结合的抗原位点）的相互 作用，导致5'和3'两端相互靠近。这一特点使核酸适体适于分子信标探针设计。其中一种 分子信标设计利用了荧光染料芘分子。当一个激发态芘分子和另一个基态芘分子近距离遭 遇的时候能形成激发态二聚体，能在比芘单体波长更长的位置释放一个光子。芘激发态二 聚体发射峰在480到500nm，而芘单体的发射峰在370到400nm之间。另外，芘分子荧 光寿命比生物样品中的非特异激发荧光的寿命长，检测时可以在非特异激发荧光消失后， 再来收集激发态二聚体的荧光信号，大大提高检测的特异性和灵敏度。识别甲胎蛋白的核 酸适体可以应用于甲胎蛋白的临床检测，提高检测效率，降低检测成本。
[0007] 核酸适体与靶物质结合所呈现的高敏感性和高特异性，使其在疾病诊断中具有 良好的应用前景，尽管目前成熟的临床应用报道较少，但应用适体检测靶蛋白的研究却 不断增多，基于适体的检测新技术也不断出现。核酸适体由于其独特的化学抗体特性成为 新一代针对特定蛋白的分子药物或靶向载体，以及用于检测其特异性识别的靶分子物质。 但是目前基于核酸适体的针对于甲胎蛋白AFP诊断试剂还很缺乏，且针对于甲胎蛋白AFP的 核酸适体荧光探针检测试剂盒的开发尚未见有报道。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是针对现有的易产生操作技术误差、重复性欠佳、干扰因素很多、操 作繁琐、测试成本高等不足，提供一种基于核酸适体荧光探针的甲胎蛋白AFP试剂盒及其检 测方法。
[0009] 本发明的方案是通过这样实现的： 一种基于核酸适体荧光探针的甲胎蛋白试剂盒，其特征在于，主要成分包括:含NH4C1、 Tris、EDTA-Na2的红细胞裂解液;含MgCl2的0.2M磷酸缓冲液；甲胎蛋白标准品；甲胎蛋白核 酸适体荧光探针;所述甲胎蛋白核酸适体荧光探针为5'和3'两端分别标记荧光芘分子单体 的核苷酸单链，该核苷酸单链序列为：ggatgcggta acggtacgta cctgtatagt gtgacatcct gtctccaacc acctgctgac gtgc。该序列命名为AFP4〇
[0010] 以上所述的一种基于核酸适体荧光探针的甲胎蛋白试剂盒，所述含NH4Cl、Tris、 EDTA-Na2的红细胞裂解液为含有 1~280 mmol/L NH4CI，1~34 mmol/L Tris，l~2mmol/ LEDTA-Na2, pH 7.0~7.2;所述含MgCh的0.2M磷酸缓冲液为含有1~10mmol/L MgCh。
[0011] 以上任一所述的一种基于核酸适体荧光探针的甲胎蛋白试剂盒，其特征在于，所 述含NH4CI、Tris、EDTA-Na2的红细胞裂解液、含MgCl 2的0.2M磷酸缓冲液、甲胎蛋白标准品、 甲胎蛋白核酸适体荧光探针为配制好直接使用的液体试剂或是使用前需加水溶解的干粉 状态。
[0012] 以上所述的一种基于核酸适体荧光探针的甲胎蛋白试剂盒，其特征在于，该试剂 盒用于检测肝素抗凝全血或末梢血中的甲胎蛋白浓度。
[0013] -种用以上任一所述基于核酸适体荧光探针的甲胎蛋白试剂盒来检测甲胎蛋白 浓度的方法，其特征在于，方法步骤包括： (1)血样裂解:将血样和含NH4CI、Tris、EDTA-Na2的红细胞裂解液按1:0.5~5体积比混 勾，静置5~30min，再中速离心5~lOmin，收集上清液； (2) 混合卵育：混合卵育：取20~100μΙ步骤1)得到的上清液和30~50ul的用含MgCl2的 〇. 2M磷酸缓冲液，溶解甲胎蛋白核酸适体荧光探针得到的甲胎蛋白核酸适体荧光探针试剂 混合，室温下卵育5~15min，使甲胎蛋白核酸适体荧光探针与血样充分结合，得到测试液； (3) 荧光检测：荧光检测仪检测步骤2)得到的测试液50ul，在荧光检测仪荧光激发后， 读取荧光激发后20至100ns时间段内波长在480~500nm的荧光值； (4) 结果计算:使用生物医学作图软件，参照甲胎蛋白标准样品制作的标准曲线，结合 步骤3)中检测到的荧光值计算出血样中甲胎蛋白的浓度。
[0014] 以上所述的生物医学软件为Sigma plot软件，于市面上可以购买到。
[0015] 以上所述的一种用基于核酸适体荧光探针的甲胎蛋白试剂盒来检测甲胎蛋白浓 度的方法，其特征在于，所述甲胎蛋白核酸适体荧光探针试剂中甲胎蛋白核酸适体荧光探 针浓度为200~400 nmol/L，其特性还在于，所述甲胎蛋白核酸适体荧光探针为5'和3'两端 分别标记焚光花分子单体的核苷酸单链，该核苷酸单链序列为：ggatgcggta acggtacgta cctgtatagt gtgacatcct gtctccaacc acctgctgac gtgc〇
[0016] 甲胎蛋白核酸适体荧光探针不与甲胎蛋白结合时，核酸适体处于比较松散的结 构，5'和3'两端的芘分子单体相互游离，荧光激发后发射波长在370~400nm之间；甲胎 蛋白核酸适体荧光探针与甲胎蛋白结合时，甲胎蛋白诱导其发生结构改变，核