一种多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶的检测方法

文档序号:9842711阅读:926来源:国知局
一种多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)的检测方法,特别是一种PARP 检测的电化学方法,属于分析化学领域。
【背景技术】
[0002] 多聚腺苷二磷酸核糖基化是由PARP家族所催化的一类必不可少的蛋白质翻译后 修饰过程。在该过程中,PARP由特定的DNA激活,对底物烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)进行切 害J,使其裂解成为烟酰胺和腺苷二磷酸核糖(ADP核糖),并将后者聚合至受体蛋白,通过若 干重复反应,即可形成一个线性或分枝结构的ADP-核糖聚合物(PAR)。该聚合物一般含有 200个左右的ADP核糖单元,同时具有很高的电负性。人体内约90 %的多聚腺苷二磷酸核糖 基化修饰反应,都是由PARP所完成的,它在DNA修复、转录调控、细胞凋亡等方面起到重要作 用。同时,PARP抑制剂也是有效的癌症治疗辅助药物。
[0003] 现今,PARP的常见检测技术主要包括放射性免疫法、荧光法以及酶联免疫法等。这 些检测方法往往需要昂贵的仪器,同时需要对催化底物进行放射性标记或酶标记。众所周 知,标记过程往往是非常耗时且昂贵,甚至可能会导致生物分子的变性。电化学检测技术具 有设备简单,价格低廉、灵敏度高、简便快捷,同时可以实现无标记检测等优点,近年来,被 成功的应用于蛋白质蛋白糖基化和磷酸化等后修饰过程的检测。

【发明内容】

[0004] 本发明的目的是发挥电化学检测技术的优势,建立一种简单、无需标记且成本低 廉,同时又具有高灵敏度的PARP检测方法。
[0005] 本发明的技术方案:一种PARP的电化学检测方法,利用经典巯基自组装的方式将 能够与PARP特异结合的单链DNA(c-kit-l)修饰于金电极表面,经处理使c-kit-Ι形成四聚 体构型;与PARP孵育后,加入该酶特定的催化底物NAD,促使PARP发生自催化产生一条带有 高负电荷的聚ADP核糖(PAR);利用PAR的高负电性吸附带正电荷的电信号分子六氨合钌 (RuHex),利用电分析方法对电极表面吸附的RuHex进行定量,通过制定标准曲线,即可实现 PARP及其抑制剂3-氨基苯甲酰胺(3-AB)的灵敏检测。
[0006] 方法包括以下步骤:金电极的预处理、c-kit-Ι修饰电极的组装、样品与修饰电极 的孵育和酶催化、PARP的电化学检测。
[0007] (1)金电极的预处理
[0008] 采用经典的预处理方式进行金电极的预处理。具体步骤如下:用1微米、0.3微米的 三氧化二粉末分别对直径为3mm金圆盘电极进行抛光,之后用酒精和超纯水分别超声5分 钟。清洗之后将金电极分别置于水虎鱼(浓硫酸:H 202的体积比=3:1)和50 %的硝酸溶液中 浸泡5分钟和30分钟。之后将处理好的电极置于0.5M H2SO4中,在0V-1.5V电压范围内进行循 环伏安扫描,扫速参数设置为〇. lV/s,直至达到稳定后,用氮气吹干电极表面。
[0009] (2)c-kit-l修饰电极的组装
[0010] 将上述(1)中经过经典方法预处理的金电极浸泡于100yL含0.2μΜ c-kit-l的固定 溶液(1〇1^1^8-!1(:1,1〇111]\11^?,0.謂似(:1,?!17.4)室温孵育12小时,再将该电极浸泡于 含ImM巯基己醇溶液1小时。用蒸馏水冲洗后,再将电极浸泡于100yL的四聚体形成溶液 (50mM Tris-HCl,100mM KCl,pH 7.4),放置于95°(:孵育5分钟后,缓慢冷却至室温(约6小 时),促使c-kit-1形成四聚体构型。
[0011] 上述c-kit-1 的序列为 j'-SH-CCC GGG CGG GCG CGA GGG AGG GGA GG-3'。
[0012] (3)样品与修饰电极的孵育和酶催化
[0013] 将上述(2)中c-kit-Ι修饰的金电极与100yL含有不同浓度PARP的反应溶液(50mM Tris-HCl,50mM KCl,2mM MgCl2,50yM Zn(0Ac)2,pH 7.4)25°C孵育 1 小时,再将电极浸泡于 100yL含有500μΜ NAD反应溶液中,25°C孵育1小时。
[0014] (4)PARP的电化学检测
[0015] 将经过上述(3)处理的电极置于5mL含5μΜ六氨合钌(RuHex)的缓冲溶液(10mM 1^8-!1(:1,?!17.4)中,进行电分析定量检测。本检测采用的电化学工作站(01166(^),以饱 和甘汞电极为参比电极,铂电极为对电极。使用的扫描方法为方波伏安法,参数设置:初始 电位-0.5V,终止电位-0.2V,电位增量0.004V,振幅0.025V,频率30Hz JARP越多,吸附的电 信号分子RuHex也就越多,因此,得到的电化学信号也就越大。以RuHex的电化学信号为纵坐 标,PARP的浓度为横坐标,绘制标准曲线,计算PARP的浓度,即可实现PARP的灵敏检测。 [0016] (5)3-AB的检测步骤如下:
[0017] 不同浓度的3-AB分别与100yL含1U的PARP的反应溶液于4 °C孵育12小时。将经过 (2)处理的c-kit-Ι修饰金电极与经3-AB处理的PARP孵育,孵育的过程同(3),再经(4)的检 测过程,得到经不同浓度3-AB处理的PARP的电化学信号,绘制标准曲线,计算出的3-AB浓 度。
[0018] 在〇.01U-1U范围内,电信号随着PARP浓度的升高而增加,电信号与浓度存在线性 关系;在1ηΜ-50ηΜ的范围内,电信号随3-AB浓度的升高而降低,电信号与浓度存在线性关 系。
[0019] 本发明的有益效果:方法简便快速、灵敏度高,实现了 PARP及其抑制剂的无标记检 测,简化了实验步骤,避免了标记过程,对各类疾病包括癌症的监控与治疗具有重要意义。
【附图说明】
[0020] 图1:PARP的检测原理图。
[0021 ]图2:不同浓度PARP存在下,电化学信号值与PARP浓度关系标准曲线图。
[0022]图3:不同浓度3-AB处理1U PARP,电化学信号值与3-AB浓度关系标准曲线图。
【具体实施方式】
[0023]实施例1 .PARP标准溶液电化学信号值-浓度标准曲线图的测定
[0024]将100yL不同浓度PARP标准液分别按照上述步骤与c-ki t-Ι修饰的金电极孵育、催 化并测电化学信号。如图2所示电化学信号值(ip)与PARP浓度的变化关系曲线,在 PARP0.01U-1U范围内,ip与浓度存在线性关系,线性回归方程为y = -0.8912-2.17559x,R2 =0.998,式中7为31¥的峰电流丨?(以4),1为?六1犯的浓度〇])。
[0025]实施例2.3-AB标准溶液电化学信号值-浓度标准曲线图的测定
[0026] 不同浓度的3-AB分别与100yL含1U的PARP的反应溶液于4°C孵育12小时。分别按照 上述步骤与c-kit-Ι修饰的金电极孵育、催化并测电化学信号。如图3所示电化学信号值 (ip)与3-AB浓度的变化关系曲线,3-AB在1ηΜ-50ηΜ范围内,ip与浓度存在线性关系,线性回 归方程为7 = -3.32915+0.038981,妒=0.997,式中7为31¥的峰电流丨?(以六),1为3-六8的浓度 (nM)〇
【主权项】
1. 一种多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)的检测方法,其特征在于利用经典巯基自组 装的方式将能够与PARP特异结合的单链DNA(c-kit-l)修饰于金电极表面,经处理使c-kit-1形成四聚体构型;与PARP孵育后,加入该酶特定的催化底物尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NAD),促使PARP发生自催化产生一条带有高负电荷的聚腺苷二磷酸核糖(PAR);利用PAR的 负电荷吸附带正电荷的电信号分子六氨合钌(RuHex),利用电分析方法对电极表面吸附的 RuHex进行定量,通过制定标准曲线,即可实现PARP及其抑制剂3-氨基苯甲酰胺(3-AB)的灵 敏检测。2. 根据权利要求1所述的PARP的检测方法,其特征是利用经典巯基自组装的方式将c-kit-Ι修饰于金电极表面,经处理使c-kit-Ι形成四聚体构型。该修饰过程,首先将经过经典 方法预处理的金电极浸泡于l〇〇yL含0.2μΜ c-kit-Ι的固定溶液(10mM Tris,10mM TCEP, 0.1M NaCl,pH 7.4)室温孵育12小时,再将该电极浸泡于1禮巯基己醇溶液1小时。用蒸馏水 冲洗后,再将电极浸泡于1〇(^1四聚体形成溶液(5〇11111^8-!1(:1,10〇11111((:1,?!17.4),放置 于95°C孵育5分钟后,缓慢冷却至室温(约6小时),促使c-kit-1形成四聚体构型。3. 根据权利要求1所述的PARP的检测方法,其特征是c-kit-Ι修饰的金电极与PARP孵育 后,加入该酶特定的催化底物NAD,促使PARP自催化产生一条带有高负电荷的PAR。上述2中 c-kit-Ι修饰的金电极与100yL含有不同浓度PARP的反应溶液(50mM Tris-HCl,50mM KC1, 2mM MgCl2,50yM Zn(0Ac)2,pH 7.4)25°C孵育 1 小时,再将电极浸泡于 100yL含有500μΜ NAD 反应溶液中,25°C孵育1小时。4. 根据权利要求1所述的PARP的检测方法,其特征是利用PAR的负电荷吸附带正电荷的 电信号分子六氨合钌(RuHex),利用电分析方法对电极表面吸附的RuHex进行定量,通过制 定标准曲线,通过电信号与PARP浓度的关系,即可实现PARP酶活性的灵敏检测。将经过上述 3处理的电极置于51^含5以11?11!161的1〇11111^8-!1(:1缓冲溶液(?!17.4)中,进行电化学定量 分析。扫描方法为方波伏安法,参数设置:初始电位-0.5V,终止电位-0.2V,电位增量 0 · 004V,振幅 0 · 025V,频率 30Hz。
【专利摘要】本发明属于分析化学技术领域,涉及一种多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)的检测方法及其应用。本发明主要是利用经典巯基自组装的方式将能够与PARP特异结合的单链DNA(c-kit-1)修饰于金电极表面,经处理使c-kit-1形成四聚体构型;与PARP孵育后,加入该酶特定的催化底物尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD),即可促使PARP自催化产生一条带有高负电荷的聚腺苷二磷酸核糖(PAR);利用PAR的负电荷吸附带正电荷的电信号分子六氨合钌(RuHex),通过电分析方法对电极表面吸附的RuHex进行定量,通过电化学信号与PARP浓度的关系,绘制标准曲线,通过测量待测样品的电化学信号,通过计算即可实现PARP的灵敏检测。该方法具有好的重复性,高的灵敏度,可应用于PARP及其抑制剂3-氨基苯甲酰胺(3-AB)的检测。
【IPC分类】G01N27/26, G01N27/48
【公开号】CN105606671
【申请号】CN201610040362
【发明人】许媛媛, 孙杨杨, 卢辰赫
【申请人】南京农业大学
【公开日】2016年5月25日
【申请日】2016年1月18日
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