同时检测八种猪病相关抗体试剂盒及其使用方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及同时检测猪病相关抗体试剂盒,尤其涉及同时检测猪瘟病毒(CSFV)、 猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪蓝耳病毒(PRRSV)、猪圆环病毒(PCV2)、猪流行性 腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流感病毒(SIV)8种猪病相关抗体试剂盒, 本发明还涉及所述试剂盒的使用方法,属于猪病抗体的检测领域。
【背景技术】
[0002] 近几年来,随着养殖业的不断发展,畜禽饲养量日益增加,集约化、规模化养殖场 层出不穷,在养殖生产实践中,有些规模猪场对畜禽疫病的防治工作只注重免疫接种和日 常消毒,而对免疫接种后产生的免疫保护效果比较忽视,往往认为诸如猪瘟、猪细小病毒、 猪伪狂犬病、猪蓝耳病、猪圆环病等疫病已经防疫过就万事大吉,猪群就不会发病。在如今 污染程度较严重的大饲养环境中,猪群的免疫效果是受多种因素制约的,如何判断猪群的 抗体水平是否达到保护猪群且不发生疫病,抗体监测是唯一最直接、最有效的手段,因此加 强抗体监测工作在养殖和防疫中的作用是举足轻重的。
[0003] 抗体监测是通过血清学试验的方法,即用已知抗原检测被检血清中有无相应的特 异性抗体,其作用是检验免疫效果和进行疫病诊断。对于猪疫病免疫水平的监测方法可采 用血凝试验(HA)、血凝抑制试验(HI)、胶体金免疫层析技术(试纸条)、酶联免疫吸附法 (ELISA)或免疫印迹,但各有其不足。其中HA、HI试验检测方法具有及时、准确、易于操作、基 层适用的特点,对被检血清能作定性分析,又可同时检测数份样品,既能反映单个个体的免 疫状态,也能反映整个群体的免疫状态,特别适用于规模猪场的免疫效果的检测,但该方法 只是针对具有血凝性的病毒及其抗体检测;胶体金免疫层析技术(试纸条)是现地疫情的快 速鉴别和免疫水平监测常用技术,整个试验只需20分钟,操作简便、快速、准确,灵敏度高、 结果直观、容易判定。胶体金免疫层析技术可提示病毒抗体的存在,但一次试验只能检测单 一指标,通量低,不能对病毒抗体的种类进行具体客观的评价,因此其特异性的证实需要其 他技术如免疫印迹法、ELISA等进行二级确认试验,并且对胶体金免疫层析技术的鉴定有一 定的主观性,因而对结果的解释可能在不同时间点、不同观察者之间存在差异;酶联免疫吸 附法(ELISA)具有成熟度高、灵敏度高、特异性强、操作方法简便快速、无放射性污染且检测 结果排除了认为的主观判断,以及应用范围广等很多优点,但同样存在一次试验只能检测 单一指标,通量低,检测成本较高,在猪疫病免疫水平的监测应用推广方面存在着极大的局 限性;免疫印迹诊断试剂是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种免疫生 化技术,具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性的优点。但是在 SDS-PAGE的过程中,许多抗原决定簇的构像可能遭到破坏,不能与特异性抗体发生或者发 生非特异性结合,造成结果判断错误。
[0004] 基于以上问题,亟待开发出一种先进、简便、可同时进行同类疫病同时诊断的新方 法,对猪疫病免疫水平的监测进行改进,有利于猪养殖业的进一步发展。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的之一是提供同时检测猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬 病毒(PRV)、猪蓝耳病毒(PRRSV)、猪圆环病毒(PCV2)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性 胃肠炎病毒(TGEV)、猪流感病毒(SIV)8种猪病相关抗体试剂盒,该试剂盒具有敏感度高、特 异性强、准确性好,操作简便,样品消耗少,结果判断客观等优点;
[0006] 本发明的目的之二是在体外同时检测猪瘟病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪蓝 耳病毒、猪圆环病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流感病毒8种猪病相关抗 体的方法。
[0007] 本发明为达到上述目的是通过以下技术方案实现的:
[0008] 本发明首先公开了同时检测猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病毒 (PRV)、猪蓝耳病毒(PRRSV)、猪圆环病毒(PCV2)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠 炎病毒(TGEV)、猪流感病毒(SIV)8种猪病相关抗体试剂盒,包括:反应卡、酶联试剂、显色 剂、终止液、浓缩洗涤液、样品稀释液;
[0009] 其中,所述反应卡由载片和固定在载片上的包被有猪瘟病毒、猪细小病毒,猪伪狂 犬病毒、猪蓝耳病毒、猪圆环病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流感病毒的 8条平行的抗原检测线和1条由猪IgG划线而成的对照线的硝酸纤维素膜组成,其中每一检 测线和对照线对应于载片反应区中一个彼此分隔的反应槽中,形成独立的检测区域;所述 的酶联试剂为碱性磷酸酶标记的兔抗猪IgG;所述的显色剂为5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸;所 述的终止液为1 X磷酸盐缓冲液;所述的样品稀释液为1 X磷酸盐缓冲液;所述的浓缩洗涤 液为10 X磷酸盐缓冲液。
[0010] 所述反应卡的制备包括以下步骤:将猪瘟病毒、猪细小病毒,猪伪狂犬病毒、猪蓝 耳病毒,猪圆环病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流感病毒8种猪病特异性 抗原及猪IgG划线于硝酸纤维素膜上,包被,封闭,固定载片,即得。
[0011] 优选的,所述反应卡的制备包括以下步骤:(1)包被:将0.5ul的猪瘟病毒、猪细小 病毒,猪伪狂犬病毒、猪蓝耳病毒,猪圆环病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、 猪流感病毒8种猪病特异性抗原及猪IgG划线于硝酸纤维素膜上,4°C包被16-24个小时;(2) 封闭:用50-200ul的封闭液,37°C封闭0.5-3小时,用稀释10倍的浓缩洗液洗涤,晾干后,于 2-8°C保存备用,其中,所述封闭液为含0 · 05-0 · 5%Tween20,1-5%BSA,5-10%脱脂奶粉,5-10%蔗糖,〇. 01-0.1M磷酸盐缓冲液或者Tris缓冲液;(3)固定载片:将所制备的检测膜条固 定在载片上,其中每一检测线对应或放置于载片反应区中一个彼此分隔的反应槽中,形成 独立的检测区域,得到反应卡。
[0012] 所述的包被用抗原为灭活纯化的猪瘟病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪蓝耳病 毒、猪圆环病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流感病毒等全病毒组成,纯度 达90%以上。
[0013] 其中,所述猪瘟病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪蓝耳病毒、猪圆环病毒、猪流 行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流感病毒8种猪病和猪IgG的抗原浓度为均为0.1-5 · Oug/ml〇
[0014] 优选的,所述猪瘟病毒抗原浓度2.Oug/ml,猪细小病毒抗原浓度1.Oug/ml,猪伪狂 犬病毒抗原浓度4. Oug/ml,猪蓝耳病毒抗原浓度3. Oug/ml,猪圆环病毒抗原浓度1. Oug/ml, 猪流行性腹泻病毒抗原浓度3 . Oug/ml,猪传染性胃肠炎病毒抗原浓度5. Oug/ml,猪流感病 毒抗原浓度3.Oug/ml,猪IgG抗原浓度1 .Oug/ml。
[0015] 本发明对8种猪病的抗原浓度进行了优化,用优化好的包被缓冲液,将包被抗原稀 释成0 · lug/ml,1 · Oug/ml,2 · Oug/ml,3 · Oug/ml,4 · Oug/ml,5 · Oug/ml等六个浓度,点样于单 诊膜片,分别与猪瘟病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪蓝耳病毒、猪圆环病毒、猪流行性 腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流感病毒、猪IgG等标准阳性血清进行方阵检测,酶联试 剂稀释度为1:300,经孵育、显色、终止后采用柯达(Kodak)Q-14灰阶卡进行判断分析。以阴 性血清对照不出现斑点、阳性血清抗体效价最高,显色强度14以上的最低抗原包被浓度确 定为抗原最佳工作浓度,最终确定了猪瘟病毒抗原浓度2 . Oug/ml,猪细小病毒抗原浓度 1. Oug/ml,猪伪狂犬病毒抗原浓度4. Oug/ml,猪蓝耳病毒抗原浓度3. Oug/ml,猪圆环病毒抗 原浓度1. Oug/ml,猪流行性腹泻病毒抗原浓度3. Oug/ml,猪传染性胃肠炎病毒抗原浓度 5.Oug/ml,猪流感病毒抗原浓度3.Oug/ml,猪IgG抗原浓度1 .Oug/ml。
[0016] 本发明进一步公开了所述试剂盒在体外同时检测猪瘟病毒、猪细小病毒、猪伪狂 犬病毒、猪蓝耳病毒、猪圆环病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流感病毒8 种猪病相关抗体的方法,包括以下步骤:(1)样本前处理:静脉取血,待凝固后离心分离血 清;(2)加样:稀释血清,加入到反应卡的每一反应槽,孵育震荡;(3)洗板:样本反应结束后, 弃去反应液,振荡洗涤;(4)加入酶联试剂:向每一反应槽中加入酶联试剂,孵育震荡,反应 结束后洗膜;(5)检测:每一反应槽加入显色液,室温下反应一段时间后,观察结果;(6)结果 判定:a、阳性:在观察孔内,检测线区(T)及对照线区(C)同时出现紫色线;抗体滴度越高,检 测线(T)颜色越深。b、弱阳性:在观察孔内,检测线区(T)及对照线区(C)同时出现紫色线,但 检测线区(T)出现的颜色很浅;c、阴性:在观察孔内,只有对照线区(C)出现紫色线;d、失效: 在观察孔内,对照线区(C)和检测线区(T)都不出现紫色线;或仅检测线区(T)出现紫色线。 [0017]优选的,所述试剂盒的方法,包括以下步骤:(1)样本前处理:静脉取血,置试管待 凝固后离心分离血清,得到血清样本;(2)加样:用样品稀释液按照1:100稀释血清样本,反 应卡的每一反应槽中加入l〇〇ul稀释血清样本,孵育震荡;(3)洗板:样本反应结束后,弃去 反应液,振荡洗涤;(4)加入酶联试剂:向每一反应槽中加入lOOul酶联试剂,孵育震荡,反应 结束后洗膜;(5)检测:每一反应槽加入配置好的显色液lOOul,室温下反应一段时间后,观 察结果;(6)结果判定:a、阳性:在观察孔内,检测线区(T)及对照线区(C)同时出现紫色线; 抗体滴度越高,检测线(T)颜色越深。b、弱阳性:在观察孔内,检测线区(T)及对照线