大肠杆菌o157:h7直接型免疫荧光层析试纸的制作方法

文档序号:9842843阅读:709来源:国知局
大肠杆菌o157:h7直接型免疫荧光层析试纸的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程领域,涉及一种免疫层析试纸,特别是一种大肠杆菌0157:H7 直接型免疫荧光层析试纸。
【背景技术】
[0002] 大肠杆菌0157:H7型(Escherichia coli 0157:H7)是一种肠道出血性大肠杆菌, 是主要食源致病菌之一。由大肠杆菌〇157:H7引起的肠道感染性疾病已经成为全球关注的 公共卫生问题。大肠杆菌0157:H7感染能引起出血性结肠炎(HC),阑尾炎和结肠穿孔等严重 胃肠道并发症,严重的可引起血栓性血小板紫癜(TTP)和溶血性尿路综合症(HUS)等全身性 并发症,其中3-5 %病人死亡,约有12 %病人有严重的后遗症。而且人的感染剂量极低,摄入 10-100个活菌就可引起发病。近年来,大肠杆菌0157: H7在我国食品样本,尤其是动物肉制 品中检出率较高。在福建、北京、广东等省市的多种食品中都检测到了该菌。大肠杆菌0157: H7对外界环境具有较强适应性,对温度、pH和干燥有一定的抗性,可以在食物、沙土、水、肥 料和人工微环境中存活长达数月。
[0003] 目前大肠杆菌0157 :H7快速检测方法主要包括生化方法、分子生物学方法、生物传 感器、代谢学方法和免疫学方法等。生化方法耗时耗力,而且容易漏检自然变异株。分子生 物学方法由于其操作复杂对设备依赖度高,加之检测的准确性和重复性有待提高等原因, 故在致病菌的检测、诊断领域尚未得到广泛应用。生物传感器检测技术与传统的检测方法 相比具有选择性好、灵敏度高、分析速度快、成本低、能在线检测等优点,但它往往需要光学 或化学原件,检测需要仪器辅助,检测成本较高。代谢组学方法方便、灵敏,具有极大的应用 潜力,但只能用于菌落总数鉴定,不能用于菌种鉴定。免疫学方法是基于抗原-抗体的特异 性结合反应发展而成的蛋白质水平上的系列检测方法,主要包括酶联免疫吸附法(ELISA)、 乳胶凝集反应、免疫层析技术和蛋白芯片技术。免疫层析试纸技术在检测速度和方便性是 最为优越的免疫学检测方法。
[0004] 免疫层析试纸目前的主要发展方向是提高灵敏度、定量检测和多元检测。针对灵 敏度问题目前所采用的方法归为两类:采用纯度高、亲和力强的单克隆抗体和采用新型标 记物。上转换荧光纳米颗粒、量子点和荧光微球等为代表的新型发射光谱型标记物,光学特 性优良,纳米材料发光强度高,将它们功能化后与致病菌抗体的氨基偶联,形成稳定的发光 复合体,借助特定光源通过检测光信号强度便可将灵敏度得以一定程度的提高。但这些新 材料的制备工艺较复杂,成本较高,原材料难以获取,离实际应用距离甚远。
[0005] 荧光标记物FITC是目前应用最为广泛的荧光素,它的最大吸收光波长为490-495nm,最大发射光波长为525-530nm,呈现明亮的黄绿色焚光,在pH为9.0-9.5的条件下可 与氨基进行反应形成硫脲,FITC荧光标记技术较为成熟,标记方法简单易行,但其作为标记 物进行活菌标记应用于细菌增殖过程并未研究。

【发明内容】

[0006] 针对现有技术中的上述技术问题,本发明提供了一种大肠杆菌〇157:H7直接型免 疫荧光层析试纸,所述的这种大肠杆菌〇157:H7直接型免疫荧光层析试纸要解决现有技术 中检测食品中大肠杆菌〇157:H7的方法灵敏度不高、检测时间长、检测过程复杂的技术问 题。
[0007] 本发明一种大肠杆菌0157: H7直接型免疫荧光层析试纸,包括一个支撑层,所述的 支撑层上设置有吸附层,所述的吸附层上设置有保护层,所述的吸附层由吸附纤维层、纤维 素膜层及吸水材料层构成,所述的吸附纤维层的一端和所述的纤维素膜层的一端紧密连 接,所述的纤维素膜层的另外一端和所述的吸水材料层紧密连接,在纤维素膜层上设有检 测线,所述的检测线由抗大肠杆菌〇157:H7的单克隆抗体或多克隆抗体构成。
[0008] 进一步的,所述的吸附纤维层的材料为玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜或聚 酯膜;所述的吸水材料层的材料为吸水滤纸,所述的支撑层的材料为不吸水的韧性材料;所 述的纤维素膜层的材料为硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或羧化纤维素膜。
[0009] 进一步的,所述的检测线的检测印迹为"一"、τ'直线式印迹,或7"、"\"斜线式印 迹,或点状印迹。
[0010] 进一步的,所述保护层为吸附纤维层及吸水材料层上覆盖的保护膜;在吸附纤维 层对应的保护膜上印制有样品标记线。
[0011] 本发明还提供了上述的一种大肠杆菌0157:Η7直接型免疫荧光层析试纸的制备方 法,包括以下步骤:
[0012] 1) 一个制备大肠杆菌0157: Η7单克隆抗体或多克隆抗体的步骤;
[0013] 2)-个制备吸附纤维层的步骤,所述的吸附纤维层采用玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏 二氟乙烯膜或聚酯膜制成;
[0014] 3)-个制备纤维素膜层的步骤,所述的纤维素膜层采用硝酸纤维素膜、纯纤维素 膜或羧化纤维素膜,用点样仪在纤维素膜上喷点检测印迹,烘干后备用;
[0015] 4)-个组装试纸的步骤,将吸附纤维层、纤维素膜层、吸水材料层从左至右依次贴 在带有粘合剂的支撑层上,依次将支撑层、吸附层和保护层组装成试纸。
[0016] 进一步的,吸附纤维层的制备方法如下:将玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜 或聚酯膜浸入TBS缓冲溶液中,所述的缓冲溶液的浓度为0.01Μ,ρΗ为7.8,所述的缓冲溶液 中,还含有PVP、蔗糖、Tw-20、BSA,在所述的缓冲溶液中,PVP的质量百分比浓度为0.5 %,蔗 糖的质量百分比浓度为l%,Tw-20的质量百分比浓度为0.5%,BSA的质量百分比浓度为 1%,以浸湿为准,冻干,备用。
[0017] 本发明还提供了采用上述的直接型免疫层析试纸检测大肠杆菌0157:H7的方法, 包括如下步骤:
[0018] 1)样品前增菌:将FITC溶于DMS0,在增菌培养基中加入FITC溶液,再加入样品进行 增菌培养;
[0019] 2)试纸检测:将试纸插入样品溶液,10~20秒后拿出平放,5-10min后通过观察检 测试纸的检测线有无荧光,判断样品中是否含有大肠杆菌〇157:H7,或通过荧光读条仪进行 半定量分析。
[0020] 本发明的试纸具有以下优点:
[0021] (1)制作简单、成本低、特异性强,灵敏度高。本发明试纸及检测方法将免疫荧光技 术与免疫层析技术相结合,待检样品中的目标大肠杆菌0157:H7经带有FITC的增菌培养基 培养后便可发荧光,无需任何标记流程、制作成本低、光稳定性强,能获得比普通胶体金试 纸相当的灵敏度。该试纸只需一株抗体,无需对抗体进行任何胶体金标记或荧光标记,无需 制作金标抗体或荧光抗体纤维层,制作简单,与传统的双抗体夹心试纸相比大大的降低了 试纸制备成本。该试纸条保持了传统胶体金试纸条简便快速、灵敏度高、特异性好的的优 点,最低可检测lCFU/mL的痕量污染。
[0022] (2)简便、快速。该试纸可对食品样品增菌处理后直接检测,在紫外光下直接观测 结果,也可借助荧光阅读器直接读值,实现半定量检测。检测时只需将试纸插入被检样品10 ~20秒,5-10min内即可判定检测结果,省时省力,操作简便,一步完成。
[0023] (3)结果显示形象、直观、准确。试纸条以显示黄绿色"一"、Τ'、7"、"\"或"?"印 迹作为检测的阳性标记,表示被检样品中含有大肠杆菌0157 :Η7;不显示任何印迹,表示被 检样品中不含大肠杆菌〇157:Η7。检测结果可用肉眼直接观察,结果形象、直观、准确,简单 明了,不易出现假阳性和假阴性等人为误判。
[0024] (4)节省费用。该试纸条检测时无需另配仪器设备和其它试剂,可随时随地进行检 测,既能定性检测又能定量检测;检测费用低廉,能节省大量贵重仪器和设备的投入费用。
[0025] (5)适用范围广,便于推广应用。该试纸能满足不同层次人员的需要,包括专业化 验、海关检疫、卫生检疫、质量监测、畜产品加工、养殖户以及消费者个人等,既适于单个样 品的检测,又适
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