一种特异性诊断卵巢癌的试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及一种特异性诊断卵巢癌的试剂盒及其使用方法。
【背景技术】
[0002] 卵巢癌是一种出现在卵巢中的恶性肿瘤，五十岁到七十岁的妇女中发病率最高。 根据韩国2002年的统计，每年有大约1000-1200名的妇女诊断出罹患卵巢癌，是在韩国妇科 癌症发生中排在子宫颈癌后的第二位。
[0003] 由于其几乎没有明显症状，大约60%的卵巢癌病例最初在显著发展的阶段诊断出 来。因此，推荐妇女在一年的定期时间进行妇科癌症的体检。通常，卵巢癌的诊断由妇科医 生对卵巢进行是否已增大的体检开始。必要时，可用妇科超声显像检查卵巢肿块。此外，对 于CA125肿瘤标记物可进行验血以确定卵巢肿块是简单的囊肿还是恶性肿瘤。
[0004] 由于超声波扫描术或验血都不是完美的，这两种检查的组合是迄今为止发现卵巢 癌的最有前途的方法。医生在完全考虑了所有的数据，包括患者年龄、现在和过去的个人和 家族病史、超声显像和验血结果以及必要时观测预定一段时间后作出决定。当怀疑肿块为 癌症时，可在执行计算机辅助断层成像(CT)或核磁共振成像(MRI)后进行外科手术。在活组 织检查后证实癌症。
[0005] 硫氧还蛋白（Trx)是一种捐献氢离子给核糖核苷酸还原酶的辅酶，一种对于大肠 杆菌中DNA合成必不可少的酶。Trx用作细胞内氧化还原作用控制剂，其特征在于具有-Cys-Gly-Pro-Cys-活性部位，其中两个邻近的半胱氨酸残基可交换地存在于二硫键（S-S) 的氧化形式与二硫醇(-SH-SH)的还原形式之间。Trx是一种12kDa的蛋白质并包含有硫氧 还蛋白1 (Trxl)和硫氧还蛋白2 (TrxShTrx具有多种生物学活性。例如，Trx用作生长因子 并清除对细胞有毒的过氧化氢。此外，Trx对真核细胞中广泛使用的转录因子NF-kB(核转 录因子kB)的活性具有影响。在这方面，Trx通过裂解氧化蛋白质的二硫键将它们转变成其 还原状态来参与细胞凋亡和肿瘤发生的调节。由于这些生物学活性，Trx作为用于预防细胞 损伤的抗氧化治疗剂以及抗癌剂吸引了广泛的关注。
[0006] 现有技术已知，患有癌症的疾病的患者具有比正常人低的血浆硫氧还蛋白1水平， 因此，硫氧还蛋白1可以作为活性成分的用于诊断卵巢癌。其诊断比传统的CA125更加有效。 因此，检测硫氧还蛋白1的表达水平变得尤为重要。
[0007] 核酸适体(Aptamer,又称适配体，适配子)是能高亲和性、高特异性的结合某种生 物质的单链寡核酸分子（ssDNA或ssRNA)。核酸适体是通过指数富集配体系统进化技术 (Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment, SELEX)从人工合成 的DNA/RNA文库中筛选得到的能够高度特异性结合靶标分子的单链DNA/RNA。已报道核酸适 体的靶标包括金属离子、有机小分子、多肽、蛋白质、细胞甚至组织等。核酸适体的分子识别 功能与抗体类似，具有与抗体分子相当甚至更强的靶标识别能力。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是提供一种特异结合TRX-1的核酸适体及其试剂盒。
[0009] 本发明提供的核酸适体，是序列表的序列1-16所示的单链DNA。
[0010]所述核酸适体与TRX-1蛋白具有较好的亲和能力。
[0011] 还可将所述核酸适体进行修饰或改造，得到所述核酸适体的衍生物。
[0012] 所述核酸适体的衍生物可为如下任意一种： a) 将所述核酸适体删除部分或增加部分互补的核苷酸，得到的与所述核酸适体具有相 同功能的核酸适体的衍生物； b) 将所述核酸适体进行核苷酸取代或部分修饰，得到的与所述核酸适体具有相同功能 的核酸适体的衍生物； c) 将所述核酸适体的骨架改造为硫代磷酸酯骨架，得到的与所述核酸适体具有相同功 能的核酸适体的衍生物； d) 将核酸适体改造为肽核酸，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生 物； e) 将所述核酸适体连接上荧光、放射性和治疗性物质后，得到的与所述核酸适体具有 相同功能的核酸适体的衍生物。
[0013] 所述核酸适体可用于制备检测TRX-1的试剂盒。
[0014] 利用本发明的核酸适体，可以捕获中唾液中的中的TRX-1，从而用于相关卵巢癌筛 查。利用本发明的核酸适体，具有高灵敏、成本低、易制备、易保存的优点。本发明具有很高 的应用价值。
【具体实施方式】
[0015] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0016]实施例1 TRX-1蛋白的获得 根据"唐文心，硫氧还蛋白-1的生物学功能研究，《华中科技大学》2009年"中的方法， 表达出TRX-1蛋白，并且纯化。
[0017] 实施例2核酸适体的筛选和制备 设计两端包含大约20个核苷酸、中间包括个核苷酸的随机核酸文库如下： '-TGCATTGAACCTGACATGTA(N39)TTGACATGCCATTGATGCAGC-3' ；N39代表 39 个随机核苷 酸。
[0018] 将单链DNA文库扩增为双链DNA，产物经2%琼脂糖凝胶电泳并切胶回收纯化；以回 收的双链DNA为模板，体外转录出单链RNA随机文库，转录产物经PAGE纯化。75 yg RNA文库 经硝酸纤维素膜反筛去除与膜结合的RNA分子，然后与2ug TRX-1蛋白，37°C孵育30min，反 应液经硝酸纤维素膜滤过，洗涤滤膜;然后将滤膜剪碎，置于洗脱缓冲液(6mol/L尿素，0. 55mol/L醋酸铵，1.5mmol/L EDTA，0. 15% SDS)中煮沸5min，离心，取上清，无水乙醇沉淀 RNA，并重新溶解于20 μL DEPC水中；以RNA为模板RT-PCR扩增双链DNA，体外转录出RNA文 库用于下一轮筛选;每轮筛选过程中RT-PCR得到双链DNA文库，以该双链DNA为模板体外转 录出RNA适配子库，筛选共进行10轮。得到了 16个适配子，其序列分别为SEQ ID Ν0:1-16所 示。具体序列如下所示：
实施例3蛋白结合适配子的性能测定 将适配子分别取2.0μ g，用牛小肠碱性磷酸酶(CIP) 37°C消化lh，纯化回收去磷酸化 的RNA ;通过T4多核苷酸激酶标记[γ -32P]ATP于去磷酸化的RNA分子末端。lOnmol放射 性标记的适配子分别与不同浓度（1-200ηΜ)的TRX-1 37°C孵育30min，各组反应液经硝酸 纤维素膜滤过，洗涤滤膜，干燥滤膜，液闪计数仪测定滤膜上残留的放射量，同一样品平行 做两次测定。计算各个适配子与目的蛋白的解离常数。结果如下：
实施例4所述适配子特异性分析以及稳定性分析 分别采用人血白蛋白，免疫血清球蛋白，pgl20蛋白，大肠杆菌外膜蛋白A，COCH蛋白， TRX-1蛋白，与16条适配子进行特异性检测，经过结合试验发现，这些适配子都不与这些蛋 白相结合，而只与TRX-1蛋白结合保持较高的特异性。
[0019] 将所述的适配子，取0.2ug，分别置于常温的血清、水溶液中，放置三周。通过RT-PCR检测，发现三周的放置其结构稳定，没有被降解。
[0020] 实施例5所述适配子疾病的诊断 取9个卵巢癌患者和5个正常人的血液，使用生理盐水稀释，获得目标样本。
[0021 ]将16个偶联有标记的适配子分别与9个患者以及5个正常人的样本混合40min，通 过生物素分离，定量分析其中的TRX-1蛋白的含量，通过分析发现，9个卵巢癌患者中TRX-1 蛋白的含量显著增加，超过了规定的阈值。达到了卵巢癌的诊断标准。由此可见，其诊断效 果较好。
[0022]以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人 员来说，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本 发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种用于卵巢癌检测的试剂盒，其含有能与卵巢癌相关蛋白特异性结合的核酸适 体。2. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:所述核酸适体的序列如SEQ ID No: 1-16任 一所示。3. -种检测卵巢癌的方法，其特征在于利用权利要求1-2任一项所述的试剂盒。
【专利摘要】本发明公开了一种检测卵巢癌的试剂盒。本发明提供的核酸适体，与人TRX-1蛋白具有较好的亲和能力。利用本发明的核酸适体，可以捕获血液中的TRX-1蛋白，通过其含量的变化来检测卵巢癌，将其制备成为相应的试剂盒，将用于卵巢癌的筛查。利用本发明的试剂盒，具有高灵敏、成本低的好处。
【IPC分类】G01N33/574
【公开号】CN105606810
【申请号】CN201510806995
【发明人】李静
【申请人】李静
【公开日】2016年5月25日
【申请日】2015年11月22日