一种基于血液凝集活性的血栓通冻干粉针质量检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医药，特别是一种基于血液凝集活性的血栓通冻干粉针质量检测方 法。
【背景技术】
[0002] 采用生物活性测定的方法对中药进行质量控制已被广泛认可。由此而制定的"中 药生物活性测定指导原则"已被《中国药典》（2010年版一部以及2015年版四部）附录收载。 当前中药(包括中成药)的"生物活性测定"已成为中药质量检测重点发展方法之一。
[0003] 血栓通冻干粉针是临床常用的活血祛瘀中成药，具有扩张血管，改善血液循环作 用，常用于视网膜中央静脉阻塞，脑血管病后遗症，内眼病，眼前房出血等，因疗效确切，被 遴选为国家基本药物，其质量控制方法为：以人参皂苷Rgl为对照品，采用高效液相法检测 三七总皂苷的含量。然而三七总皂苷是一类化学成分而不是单一成分，具有不同成分之间 比例关系复杂，药理作用靶点不单一，功效多样等特点。仅仅以人参皂苷Rgl为对照品，间 接反映三七总皂苷的含量，难以综合关联血栓通冻干粉针的整体功效。因此含量检测（测 定）的方法是不能完全达到血栓通冻干粉针内在质量控制目标的。生物活性检测的方法相 对于化学含量检测方法直接关联药效，尤其适用于成分复杂的中药、中成药、生物制剂等药 物的质量检测。因此，采用生物活性检测的方法对血栓通冻干粉针进行质量控制符合中成 药自身特点，将有独到优势，但至今未见有采用生物活性检测血栓通冻干粉质量方法的公
【发明内容】
[0004] 针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种基于血液凝 集活性的血栓通冻干粉针质量检测方法，可有效解决血栓通冻干粉针的质量检测，从而实 现对血栓通冻干粉针的质量控制，保证血栓通冻干粉针的质量问题。
[0005] 本发明解决的技术方案是，由以下方法实现： (1 )、制备供测试的血浆，将柠檬酸盐缓冲液〇. 2ml装入注射器，用注射器经成年雄性家 兔耳缘动脉吸取血液5ml，离心，得血浆； (2) 、将血栓通冻干粉针用生理盐水倍比稀释成10个浓度梯度； (3) 、将血浆点入血浆点样孔板中，再将10个不同浓度梯度的血栓通冻干粉针分别加入 点入血浆的10个孔中，每个浓度重复3孔;并设阴性对照组； (4) 、检测血凝块形成的时间：用凝集检测仪（Schnitter+Gross协同凝集检测仪， Amelung，Brake)检测血衆样的血凝块形成时间并记录； (5) 、血栓通冻干粉针质量的判定:根据步骤(4)凝集检测仪记录的血凝块形成的时间， 以不出现凝血块的血栓通冻干粉针的最大稀释倍数的时间作为其量值(作倍比稀释，稀释 倍数以2为底的指数形式表示，以该指数为其量值），用于判定血栓通冻干粉针的质量，量值 越大，血栓通冻干粉针的活血功效越好，质量越优，从而测定出血栓通冻干粉针的质量。
[0006] 本发明方法科学，易操作，测定速度快，效率高，方法稳定可靠，准确，是血栓通冻 干粉针质量检测上的一大创新，有效保证了血栓通冻干粉针的质量，防止伪劣产品对人身 体健康的危害，经济和社会效益巨大。
【具体实施方式】
[0007] 以下结合具体情况对本发明的【具体实施方式】作详细说明。
[0008] 本发明在具体实施中，由以下方法实现： (1) 、制备供测试的血浆 在温度20-26 °C、湿度60%的环境下，将PH 4.5的柠檬酸盐缓冲液0.2ml (或浓度为 lOOmmol/L的柠檬酸盐缓冲液0.2ml)装入注射器，用注射器经成年雄性家兔耳缘动脉吸取 血液5ml，置于离心管中，以1500g的速度离心10min，得血浆； (2) 、将血栓通冻干粉针稀释成不同浓度，方法是，用质量浓度0.9%的生理盐水将血栓 通冻干粉针倍比稀释成10个浓度梯度； 所述的倍比稀释是指稀释后的下一级血栓通冻干粉针(样品）的浓度是上一级浓度的 0.5 倍； (3) 、将步骤（1)制得的血浆点入血浆点样孔板中的3排，每排10孔，每孔0.1ml;另将血 浆点入另相邻的3个孔中，每孔0.1ml，作为阴性对照组，在37°C下孵育5min，加入0.2ml人促 凝血酶(Thromborel Behring Werke，Marburg);将步骤(2)制得的10个不同浓度梯度的血 栓通冻干粉针0.1ml用排枪分别加入点入血浆的10个孔中，每个浓度重复3孔，阴性对照组 中加入质量浓度〇. 9%的生理盐水0. lml; (4) 、检测血凝块形成的时间：用凝集检测仪（Schnitter+Gross协同凝集检测仪， Ame 1 ung，Brake )检测步骤(3 )给出的各孔中血衆样的血凝块形成时间并记录； (5) 、血栓通冻干粉针质量的判定:根据步骤(4)凝集检测仪记录的血凝块形成的时间， 在lOOrnin不出现凝血块的血栓通冻干粉针的最大稀释倍数作为其量值(作倍比稀释，稀释 倍数以2为底的指数形式表示，以该指数为其量值），用于判定血栓通冻干粉针的质量，该量 值越大，血栓通冻干粉针的活血功效越好，质量越优，从而测定出血栓通冻干粉针的质量。
[0009] 所述的倍比稀释将血栓通冻干粉针用生理盐水稀释成10%浓度溶液作为母液，以 倍比稀释的方式进行稀释，当21倍稀释时，浓度为5.00%;当2 2倍稀释时，浓度为2.50%;当23 倍稀释时，浓度为1.25%以此类推，当在lOOrnin时，大于0.009766%浓度均不出现凝血反应， 则称血栓通冻干粉针生物活性量值为10 (10%的初始浓度经21()倍稀释后浓度为0.009766%)， 按照实验条件，常规指标检测合格的样品，本方法检测的生物活性量值为6以上，说明产品 合格或较优，可进行工业化生产。
[0010] 本发明是申请人经科学研究、试验和对实践总结作出的创造性劳动结晶，有关试 验资料如下： 1、试验方法及步骤： 1.1供试血浆的制备 取三只大耳白成年雄性家兔，通过耳缘动脉，用含有0.2ml 100mm〇l/L柠檬酸盐缓冲液 (PH 4 · 5，Behring Werke，Marburg)的注射器分别取血约5ml，立即拌动混合于塑料离心管 中，以1500g的速度离心10min。将血浆转移至另一塑料离心管中备用。操作的环境为普通药 理实验室，室温控制24°C-26°C，湿度60%。
[0011] 1.2受试药的加入： 1.2.1血栓通冻干粉针采用倍比稀释的方式稀释10个浓度梯度，采用0.9%生理盐水稀 释。
[0012] 1.2.2将步骤1.1所得血浆点样96孔板中，每孔0.1ml，共点样3排，每排点10孔。另 外将血浆点三孔每孔0. lml作为阴性对照。在37°C条件下孵育5min，加入0.2ml人的促凝血 酶(Thromborel Behring Werke，Marburg)，将步骤1.2.1得到的10个浓度梯度的血检通 冻干粉针〇. lml用排枪加入10个孔中，每个浓度重复3孔。阴性对照只加0. lml 0.9%的生理 盐水。
[0013] 1.3检测血凝块形成的时间： 在步骤1.2.2加样完成同时打开凝集检测仪（Schnitter+Gross协同凝集检测仪， Amelung，Brake)检测血凝块形成的时间并记录。
[0014] 1.4结果的判定 确定观察时间，以该时间点不出现凝血块的血栓通冻干粉针的最大稀释倍数作为其量 值(作倍比稀释，稀释倍数以2为底的指数形式表示，以该指数为其量值），用于评判血栓通 冻干粉针的质量，该量值越大说明血栓通冻干粉针的活血功效越好，质量也越优。
[0015] 如，为方便实验及计算，先将血栓通冻干粉针用生理盐水稀释成10%浓度溶液作为 母液，以倍比稀释的方式进行稀