冬油菜叶片质外体抗冻蛋白标样制备方法及蛋白裂解液的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属于蛋白质组学技术领域，涉及一种冬油菜叶片质外体抗冻蛋白标样制备方法;本发明还涉及一种该制备方法所用的蛋白裂解液。
【背景技术】
[0002]近年来，随着我国冬油菜北移和北方冬油菜新产区的逐步形成，白菜型冬油菜成为了北方地区重要的油料作物和生态作物，同时也是促进北方耕作制度改革的先驱作物(孙万仓，马卫国，雷建民，等.冬油菜在西北旱寒区的适应性和北移的可行性研究[J].中国农业科学，2007，40(12): 2716-2726)。由于我国北方地区冬季旱寒等严酷的气候，严重影响冬油菜的生长发育，使得抗寒性一般的冬油菜越冬困难，因此研究冬油菜的抗寒性具有重要意义。徐呈祥等对丰富多样的低温诱导蛋白质进行研究，发现其中的抗冻蛋白在植物抗寒冷机制中有着十分重要的作用(提高植物抗寒性的机理研究进展[J].生态学报，2012，32(24): 7966-7980.)。抗冻蛋白(Antifreeze Protein，AFP)是一类可以吸附到冰晶表面抑制冰晶生长速度、修饰冰晶形态、降低溶液冰点、抑制冰晶重结晶的蛋白质，对研究植物抗寒有重大意义。Griffith等在1992年第一次明确提出获得植物内生的抗冻蛋白，他们从经低温锻炼能够忍受细胞外结冰的冬黑麦中发现了内源产生的AFP，并从冬黑麦叶片的质外体中提取并部分纯化了该蛋白；1994年费云标等从常绿抗冻植物沙冬青叶片中分离得到了抗冻蛋白；Meyer等在1999年发现胡萝卜AFP基因在非低温胁迫下不表达，在低温胁迫下表达水平迅速提高。
[0003]SDS-PAGE(十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺)凝胶电泳是分析生物体蛋白质常用的方法，其技术多采用Laemmli(1970)分析细菌蛋白的方法，该方法通过利用蛋白质具有分子量大小不同的特性分离不同的蛋白质，分离效果显著。之后随着二维电泳的逐渐发展，双向电泳成为了蛋白质组研究领域中的关键技术之一。但无论是SDS-PAGE凝胶电泳还是双向电泳，样品的制备都是其中关键的一步，在样品制备过程中应遵循三个基本原则:I)尽可能的提尚样品蛋白的溶解度，减少蛋白质的损失;2)减少对蛋白质的人为修饰;3)破坏蛋白质与其他生物大分子的相互作用，使蛋白质处于完全变性状态。由于提取的植物材料不同，使用的蛋白裂解缓冲液也各不相同，需要通过不同试剂的合理组合，才能达到对样品蛋白的最大提取。在提取过程中通过使用一些辅助增溶药剂来提高蛋白质的溶解性，特别是膜蛋白和疏水蛋白，其中尿素是较理想的中性增溶剂，它能很好地提高蛋白质的溶解度，9 mol/L以上的尿素适用于水稻叶片蛋白质的提取;硫脲是另一种增溶剂，在膜蛋白的提取中应用较多(Pasquali等1997)，但由于它不溶于水、溶于高浓度尿素的特性，需与尿素混合使用，硫脲使用浓度为2 mol/L;去垢剂也可有效地增加大多数蛋白质的溶解性，早期常用Triton X-100和NP-40等非离子去垢剂，近几年改用CHAPS等新型两性离子去垢剂;还原剂最常用的是二硫苏糖醇(DTT)。专利《冬油菜根质外体抗冻蛋白的提取方法》(专利号CN201310313597.0，公告号CN103333234A，公告日2013.10.2)中公开的含0-巯基乙醇的蛋白裂解液在植物蛋白提取中应用广泛，但β-巯基乙醇是剧毒物质，对人体危害极大，并且该裂解液对质外体抗冻蛋白样品的裂解不够充分，使得蛋白质的损失较大;专利《一种蛋白标样的制备方法及蛋白裂解液K专利号ZL201010197856.4，公告号CN101865796B，公告日2011.12.21)中公开了将标准蛋白样品溶于含尿素的蛋白裂解液中，得到蛋白质标样的方法，在该蛋白质标样制备过程中使用含7?9M尿素的蛋白裂解液。但是上述专利中的蛋白裂解液不适用于冬油菜质外体抗冻蛋白的裂解，获得的蛋白质含量较低，且蛋白图谱不清晰。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种冬油菜叶片质外体抗冻蛋白标样制备方法，能获得较高含量的蛋白质，检测到的蛋白条带数多而清晰。
[0005]本发明的另一个目的是提供一种上述制备方法中所用的蛋白裂解液。
[0006]为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是:一种冬油菜叶片质外体抗冻蛋白标样制备方法，将冬油菜叶片质外体抗冻蛋白干粉溶于含尿素的蛋白裂解液中保存，即得冬油菜叶片质外体抗冻蛋白标样；
所述的冬油菜叶片质外体抗冻蛋白干粉是用质外体抗冻蛋白提取法从强冬性白菜型冬油菜油菜陇油7号和强冬性甘蓝型冬油菜Vis1n中提取的。
[0007]本发明所采用的另一个技术方案是:一种上述制备方法中使用的蛋白裂解液，该蛋白裂解液中含有尿素，且尿素的摩尔体积浓度为6?I Omo I/L。
[0008]优选的，该蛋白裂解液含有以下组分:6?I Omo I / L尿素、O?3mo I / L硫脲、I %?4%(%表示质量百分数)CHAPS和30?70 mmol/L DTT。
[0009]进一步优选，该蛋白裂解液含有以下组分:6?lOmol/L尿素、1%?4%(%表示质量百分数)3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐(CHAPS)和30?70 mmol/L 二硫苏糖醇(DTT)0
[0010]对上述冬油菜叶片质外体抗冻蛋白标样进行SDS-PAGE凝胶电泳检测，检测到的蛋白条带多而清晰。进行SDS-PAGE凝胶电泳检测时，冬油菜叶片质外体抗冻蛋白标样的质量体积浓度为I.0?3.0lIgAiI;使用的I X SDS凝胶上样缓冲液的体积为冬油菜叶片质外体抗冻蛋白和蛋白裂解液总体积的1/2。
[0011]该I X SDS凝胶上样缓冲液中含有以下组分:50mmol/L Tris-HCl (pH6.8)、10mmoI/L DTT、2%(m/V)SDS、0.1%溴酚蓝和 10%(V/V)甘油。
[0012]采用本发明蛋白裂解液比用含β-巯基乙醇的蛋白裂解液(按体积百分比由以下成分组成:12.5%摩尔体积浓度0.5 mol/L的Tris_HCL(pH6.8)、10%的甘油、5%的β-巯基乙醇和72.5%的(IdH2O)裂解得到的质外体抗冻蛋白样品效果更佳，得到的蛋白含量高了 9?13倍，进行SDS-PAGE凝胶电泳检测到的蛋白条带数多而清晰，毒性更小。本发明蛋白裂解液中不含有毒试剂巯基乙醇，可以减少对人体的危害。
【附图说明】
[0013]图1是对比例I和对比例2中蛋白干粉裂解后的裂解效果图。
[0014]图2是实施例1和实施例2中蛋白干粉裂解后的裂解效果图。
[0015]图3是实施例3和实施例4中蛋白干粉裂解后的裂解效果图。
[0016]图4是实施例5和实施例6中蛋白干粉裂解后的裂解效果图。
[0017]图5是对比例1、实施例1、实施例3和实施例5中蛋白干粉裂解后测得的蛋白含量直方图。
[0018]图6是对比例2、实施例2、实施例4和实施例6中蛋白干粉裂解后测得的蛋白含量直方图。
[0019]图7强冬性白菜型冬油菜陇油7号叶片中质外体抗冻蛋白SDS-PAGE凝胶电泳检测图。
[0020]图8是强冬性甘蓝型冬油菜Vis1n叶片中质外体抗冻蛋白SDS-PAGE凝胶电泳检测图。
【具体实施方式】
[0021 ]如无特殊指明，以下所采用的药品和方法均为常规药品和常规方法。
[0022]实验验证:
1.试验材料
强冬性白菜型冬油菜:陇油7号(甘肃农业大学农学院油菜育种实验室)和强冬性甘蓝型冬油菜:Vis1n(欧洲)。
[0023]2.冬油菜的培养及低温处理
I)选取籽粒饱满的冬油菜种子放入铺有两层滤纸的13cm的培养皿中，注入蒸馏水1mL，种子露白后转入装满营养土的9cm X 9cm的营养钵中，用蒸馏水浇灌，让营养土充分吸水。
[0024]2)将试验材料置于光照培养箱中，每天浇一次水，营养土浇透为宜。培养条件为:温度设为恒温25°C，每天光照14h，相对湿度为60?80%。
[0025]3)待叶片长至5?6片时，将试验材料移至生化培养箱进行低温处理，处理温度为O°C，每天光照14h，处理一周。
[0026]3.质外体抗冻蛋白法提取冬油菜叶片中的质外体抗冻蛋白
1)采样:采集经过低温处理一周后的冬油菜叶片；
2)切条:用双蒸水(ddH20)将叶片冲洗2遍，滤纸吸干表面水分后，将叶片切成I?2cm长条；
3)浸洗:用提取缓冲液(0.05M/LTris-HcU0.01M/L EDTA_Na2.2H20和0.02M/L VC)浸洗切成条的叶片2?3次；
4)抽真空:将切成条的油菜叶片放入带塞的锥形瓶中，加入80?10ml上述提取缓冲液，抽真空，真空度稳定到0.07?0.08Mpa后，继续抽真空7?1min;
5)离心:倒掉缓冲液，用滤纸吸去叶片表面溶液，放入注射器内，将注射器放入50ml离心管，在转速为6100?6200rpm、3?5°C的条件下，离心14?16min，收集离心管底部液体，SP为非质体提取物；
6)在非质体提取物中加入5倍体积的冷丙酮，-20°C预冷，-20°C沉淀10?20h后，在转速为10000rpm、4°C条件下，离心30min，倾去丙酮，沉淀在-20°C挥发丙酮，获得蛋白干粉。
[0027]对比例I
取获得的强冬性白菜型冬油菜陇油7号蛋白干粉，取含有以下组分:12.5% 0.5mol/LTr i s-HCL (pH6.8 )、10%甘油、5%β-巯基乙醇和7 2.5%双蒸水(ddH20 )的含β-巯基乙醇的蛋白裂解液。按每毫克蛋白干粉中加入20μ I含β-巯基乙醇的蛋白裂解液的比例，将含β_巯基乙醇的蛋白裂解液加入获得的蛋白干粉，室温裂解2h，裂解期间每隔30min在涡旋器上震荡，裂解2h后蛋白样品呈粘稠状如图1中的A-1;然后在转速10000rpm、4°C条件下离心15min，取上清液，在-20 °C保存备用。
[0028]对比例2
取获得的强冬性甘蓝型冬油菜Vis1n的蛋白干粉，取含有以下组分:12.5% 0.5mol/LTr i s-HCL (pH6.8 )、10%甘油、5%β-巯基乙醇和7 2.5%双蒸水(ddH20 )的含β-巯基乙醇的蛋白裂解液。按每毫克蛋白干粉中加入20μ I含β-巯基乙醇的蛋白裂解液的比例，将含β_巯基乙醇的蛋白裂解液加入获得的蛋白干粉，室温裂解2h，裂解期间每隔30min在涡旋器上震荡，裂解2h后蛋白样品呈粘稠状如图1中的A-2 ；然后在转速10000印111、4°(:条件下离心151^11，取上清液，在-20 °C保存备用。
[0029]实施例1
取获得的强冬性白菜型冬油菜陇油7号蛋白干粉，取含有以下组分:6mol/L尿素、3%CHAPS和50 mmol/L DTT的蛋白裂解液。按每毫克蛋白干粉中加入20μ1该蛋白裂解液的比例，将该蛋白裂解液加入蛋白干粉中，室温裂解2h，裂解期间每隔30min在涡旋器上震荡，蛋白样品呈澄清状，如图2中的B1-1，