一种糜蛋白酶活力检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及酶活检测技术领域，具体设及一种糜蛋白酶活力检测方法。
【背景技术】
[0002] 糜蛋白酶是来源于牛膜经提取的蛋白水解酶。由于糜蛋白酶具有能分解蛋白、抗 凝结和消炎的特性，它可用于医疗领域。糜蛋白酶能切断蛋白质肤链中酪氨酸和苯丙氨酸 的簇端肤链，因而能清创消脈，消化浓汁和坏死组织，助长新生肉芽的生长。
[0003] 酶活力是指酶催化一定化学反应的能力。酶活力的大小可用在一定条件下，酶催 化某一化学反应的速度来表示，酶催化反应速度愈快，酶活力愈高，反之活力愈低。测定酶 活力实际就是测定酶促反应的速度。酶促反应速度可用单位时间内、单位体积中底物的减 少量或产物的增加量来表示。
[0004] 糜蛋白酶分解蛋白质、酷胺和醋中的肤键，运些肤键与芳香族氨基酸，如苯基丙氨 酸、酪氨酸或色氨酸所提供的簇基团结合。糜蛋白酶已收录于中国药典，2010年版中国药典 中检测糜蛋白酶活力的方法是通过在25°C恒溫下水解底物N-乙酷-k酪氨酸乙醋，生成在 237nm紫外光下具有更低吸光值的N-乙酷-k酪氨酸，依据吸光值的变换率计算酶活力，该 方法要求在5分钟内吸光值变化率的恒定时间不得少于3分钟，在测定过程中反应体系需要 精确维持25°C恒溫，而市场上大多数国产紫外分光光度计没有恒溫适配器，进口分光光度 计具有运种装置但价格昂贵，因此很难保证恒溫，对于一个酶催化反应而言，恒定的反应溫 度是项十分重要的参数，另外，酶自身的稳定性也是对催化反应起着至关重要的左右，而蛋 白酶在水溶液中很易自我水解，因此用该法测定糜蛋白酶活力时，往往吸光值随时间变化 的线性关系较差，很难维持3分钟的恒定变化率，从而使测量不精确，重复性差。
【发明内容】
[0005] (一)解决的技术问题
[0006] 针对现有技术中糜蛋白酶活力检测存在的问题，本发明提供一种灵敏度高、稳定 性好的检测糜蛋白酶活力的方法，该方法能够在反应时间内稳定糜蛋白酶的活性并提高其 活力，使反应过程中吸光值变化呈现更加良好的线性关系，结果稳定，重复性好，检测下限 低，成本降低，且所用试剂安全无毒，可广泛应用于实验室及临床检验。
[0007] (二)技术方案
[000引为实现W上目的，本发明通过W下技术方案予W实现：
[0009] -种糜蛋白酶活力检测方法，包括如下步骤：
[0010] S1、将底物N-乙酷-精氨酸乙醋溶解于含有化的碱性缓冲液中，得到底物液备 用；
[0011] S2、供试品制备:称取0.1 g糜蛋白酶原料，加0.0012mol/L盐酸溶解定容至lOOmL， 再取出5mL用0.0012mo 1 /L盐酸稀释至1 OOmL，作为供试品液备用4 °C保存；
[0012] S3、将步骤S2制备的供试品液和步骤S1制备的底物液分别置于25°C水浴锅中预热 5分钟，再迅速将供试品液和底物溶液混合于比色皿中，置于紫外分光光度计内，在237nm波 长下检测吸光值的变化。
[OOU]优选的，步骤S1所述含有Ca2+的碱性缓冲液中〔曰2+浓度为l-20mmol/L。
[0014]优选的，步骤S1所述含有化的碱性缓冲液中化浓度为lOmmol/L。
[001引优选的，步骤別所述含有Ca2+的碱性缓冲液是Tris-肥1缓冲液，pH值为8.0，浓度为 50mmol/L。
[0016] (;巧益效果
[0017] 本发明提供了一种糜蛋白酶活力检测方法，本发明相对于现有技术的有益效果如 下：
[0018] 1、本发明通过水浴预热处理使反应体系中各反应成分处于25°C恒溫环境中，有利 于在普通紫外分光光度计内反应使用，降低成本；
[0019] 2、Tris-HCl缓冲液不与化形成沉淀，保证反应体系溶液均一稳定，利于紫外光检 测，在含有化is-HCl的碱性体系中加入Ca2+起到稳定糜蛋白酶的作用，吸光值变化恒定，同 时能提高酶活力，降低检测下限，减少样品成本；
[0020] 3、本发明糜蛋白酶活力检测方法，检测过程中反应体系吸光值随时间变化的线性 关系在中国药典方法基础上大大改善，检测结果重复性好，检测灵敏度高，稳定性好；
[0021] 4、本发明糜蛋白酶活力检测方法，使用的试剂无毒害，易于操作。
【附图说明】
[0022] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本 发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可W 根据运些附图获得其他的附图。
[0023] 图1为本发明检测糜蛋白酶活力吸光度时间变化的线性关系图：横坐标为反应时 间，单位为S ;纵坐标为吸光度值，单位为A。
【具体实施方式】
[0024] 为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例 中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是 本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员 在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0025] 本发明糜蛋白酶活力检测方法，包括如下步骤：
[0026] S1、将底物N-乙酷-精氨酸乙醋溶解于含有化的碱性缓冲液中，得到底物液备 用；
[0027] S2、供试品制备:称取0.1 g糜蛋白酶原料，加0.0012mol/L盐酸溶解定容至lOOmL， 再取出5mL用0.0012mo 1 /L盐酸稀释至1 OOmL，作为供试品液备用4 °C保存；
[00%] S3、将步骤S2制备的供试品液和步骤S1制备的底物液分别置于25°C水浴锅中预热 5分钟，再迅速将供试品液和底物溶液混合于比色皿中，置于紫外分光光度计内，在237nm波 长下检测吸光值的变化。
[00巧]且步骤SI中含有化2+的碱性缓冲液是化is-HCl缓冲液，pH值为8. ο，浓度为50mmol/ L，其中Ca2+浓度为l-20mmol/L。
[0030]本发明使用的Tris-HCl缓冲液不与Ca2+形成沉淀，溶液均一，利于吸光值测定。 化is在pH 8左右有较大缓冲能力，由于反应过程中不断有乙酸生成，能够维持较稳定的pH 环境。通过优化发现lOmmol/L可W很好的稳定和激活糜蛋白酶，在上述反应过程中，用水浴 预热反应体系至25Γ，使在紫外分光光度计内比色皿中的反应溫度能够在一定时期内维持 25°C，而加入的化可W稳定糜蛋白酶的活性，并使酶活力得到提高。
[0031