的生物电化学检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种维生素 B2的生物电化学检测方法，属于生化检测技术领域。
【背景技术】
[0002] 维生素 B2，VB2,即核黄素，化学式为Cn也0机〇6。它是一种水溶性B族维生素，在机体 的碳水化合物、蛋白质及脂肪的能量转化过程中起着重要作用，对人类健康有着重要意义。
[0003] VB2缺乏会引起人体代谢障碍，从而引发多种病变。其病变多表现为口、眼和外生 殖器部位的炎症，如口角炎、唇炎、舌炎、眼结膜炎和阴囊炎等。值得注意的是，人体自身不 能合成VB2,只能通过膳食中获取。因此，VB2含量是评估食品营养及其功能性的重要指标。同 时，由于^2缺乏是一种常见病症，所WVB2成为相关药品及保健品的重要成分，其含量也常 被作为运类商品的重要质量指标。综上，VB2含量的快速、准确测定在VB2的合成及其相关的 食品、药品及保健品行业生产中有重要意义。
[0004] 现有的VB2检测方法包括微生物法、巧光分光光度法、高效液相色谱法(册LC)、W 及质谱法。
[0005] 微生物法是国标法中常采用的一种检测VB2方法，其原理即某一种微生物的生长 (繁殖)必需某些维生素，在一定条件下，该细菌的生长情况及代谢产物与该维生素的含量 成正比，W此来测定某一维生素的含量。王光亚在《食物中核黄素测定方法的比较》一文中 (生理科学，1988，8:419-420)指出微生物法其特异性和灵敏度较高，但是方法费时，周期 较长，给实际测定过程带来不便。
[0006] 巧光分光光度法是目前应用较广泛的一种VB2检测方法。该方法利用VB2在pH 4~ 9、440~500皿激发光照射下产生黄绿色巧光的特性，根据巧光强度与浓度成正比的 原理对VB2进行定量测定。宋吉英在《巧光分光光度法测定构杞中核黄素含量》一文中（化学 世界，2012，12: 720-722)报道了使用巧光分光光度法测定了构杞中的VB2的研究方法。该 方法简便、快速，但由于食物中的巧光杂质较多，干扰测定，该方法仅适用于含乂恥较高干扰 较少的乳类，故局限了其应用发展。
[0007] HPLC测定方法是根据样品中各种物质在色谱柱中分离系数的不同，将其同样品中 干扰物分开，并根据目标检测物的分子特性选择对应的检测器进行定性定量检测。VB2的测 定通常采用巧光检测器，C18色谱柱，激发波长440nm，发射波长在525nm左右。邓洁熊等人在 《HPLC测定核黄素憐酸钢中核黄素的含量》文章中（广东药学院学报，2006，2(1):53-54) 报道了核黄素憐酸钢中VB2含量的HPLC测定方法。该方法相对简单、快速、重复性好，但是对 仪器有较高要求，样品处理较为繁琐。
[000引质谱法是纯物质鉴定的最有力工具之一，利用电场和磁场将运动的离子，按它们 的质荷比分离后进行检测的方法。Mandal等人在《Rapid determination of vitamin B2 and Bi2 in human urine by isocratic liquid chromatography》一文中（Analytica 化imica Acta, 2009, 640: 110-113)报道了分别利用高效液相色谱法和基质辅助激光解 吸电离质谱法测定人类尿液中的VB2含量。然而在进行有机物定量分析时要经过一系列分 离纯化操作，十分麻烦，并且质谱仪属于大型昂贵仪器，检测成本高。
[0009] 生物电化学传感器则是指由生物材料作为敏感元件，电极(固体电极、离子选择性 电极、气敏电极等)作为转换元件，W电势或电流为特征检测信号的传感器。由于使用生物 材料作为传感器的敏感元件，所W电化学生物传感器具有高度选择性，是快速、直接获取复 杂体系组成信息的理想分析工具。一些研究成果已在生物技术、食品工业、临床检测、医药 工业、生物医学、环境分析等领域获得实际应用。
[0010] 在特定电位控制条件下，希瓦氏菌可W在自身的富马酸还原酶（Selenite reduction by Shewanella oneidensis Μ民-1 is mediated by fumarate reductase in periplasm,SCIENTI門C 肥PORTS,2014,4:3725，D01:10.1038/srep03735)的催化作用下， 利用来源于胞外电极的电子还原富马酸，并在外电路形成电流。而VB2是希瓦氏菌实现该细 胞内外电子转移过程的电子中介体，其浓度高低与该过程的电子转移效率即外电路电流强 度大小直接相关。因此，可W直接通过反应体系的电流变化来高效、快速检测样品中得VB2 并测定其浓度，本发明基于此构建了一种新型的VB2生物电化学检测方法，经过对现有技术 的检索，并未发现有利用生物电化学方法检测VB2的报道。
【发明内容】
[0011] 本发明的目的在于提供一种新的专一性测定VB2的方法，解决现有技术中存在的 检测成本高、检测仪器昂贵、数据重复性差、操作过程(包括制备样品及样品预处理等过程） 复杂的问题。
[0012] 本发明的技术方案是： 一种维生素 B2的生物电化学检测方法，按W下步骤进行操作： (1) 将希瓦氏菌种接种至LB液体培养基进行培养，活化菌体； (2) 将活化的希瓦氏菌菌液离屯、，按一定比例将离屯、后的沉淀加入到反应缓冲溶液 中； (3) 将参比电极、工作电极、对电极安装在含有步骤(2)得到的溶液的装置中，连接信 号检测系统，组成生物电化学传感器； (4) 在步骤(3)得到的生物电化学传感器的工作电极上加载外电压，待电流输出稳定 后，向系统中加入希瓦氏菌的电子受体； (5) 待电流输出稳定，向Ξ电极系统中加入VB2样品，检测并记录电流变化值。
[OOU] 其中希瓦氏菌（Siewanella oneidensis),购自美国模式菌种保藏中屯、(ATCC);将 保存的希瓦氏菌接种至培养基进行培养，获得活化的菌体。
[0014] 其中反应缓冲液（参考：A whole-cell electrochemical biosensing system based on bacterial inward electron flow for fumarate quantification. Rong- WeiSi, Dan-DanZhai, Zhi-HongLiao, LuGao , Yang-ChunYong. Biosensors andBioelectronics68(2015)34-40)由W下物质组成，LB液体培养基：膜蛋白腺10 g/L、酵 母提取物5g/L、氯化钢5 g/L pH=7;M9培养基:化抽P04.12出0 17.8 g L-i、K出P〇4 3g [1、 NaCl 0.5 g L-i、NH4C1 10.5 g L-i、18mM乳酸钢、0.1 ml的CaCl2和 1 mM的MgS04。
[0015] 其中，步骤(2)中所述的希瓦氏菌沉淀加入到反应缓冲溶液中，其OD值控制在1.5- 2之间； 步骤(3)中参比电极为饱和甘隶电极或银/氯化银电极;工作电极为碳拉或 碳布;对电极为销丝电极； 步骤(3)中所述的信号检测系统由记录电流输出的仪器和控制电位的仪器组成，如电 化学工作站CHI 660E(上海辰华仪器有限公司）； 步骤(4)中所述希瓦氏菌的电子受体为富马酸溶液、亚硝酸溶液、亚硫酸盐溶液、硝酸 盐溶液、二甲基亚讽、硫代硫酸盐溶液或氧化Ξ甲胺溶液;进一步优选为富马酸溶液，加入 富马酸溶液浓度为5mM~饱和浓度。
[0016] 步骤(4)中所述的生物电化学传感器所加载的外电压为-1.5~0伏特。
[0017] 本发明还提供一种检测VB2的生物电化学传感器，所述的传感器包括信号检测系 统，电极系统和信号发生系统，其中所述的VB2信号发生系统包括希瓦氏菌的电子受体、希 瓦氏菌菌液和反应缓冲溶液； 其中所述希瓦氏菌的电子受体为富马酸溶液、亚硝酸溶液、亚硫酸盐溶液、硝酸盐溶 液、二甲基亚讽、硫代硫酸盐溶液或氧化Ξ甲胺溶液，优选为富马酸溶液。
[001引本发明的有益效果： 本发明使用了简单的电化学仪器来实现电压控制和电流信号记录，所W检测的成本低 廉；由于VB2形成的电流响应是和电化学反应转移的电子数直接相关的，因此根据电流响应 设备的精确度能够达到高的灵敏度、稳定性和重复性（当同时制备Ξ个及W上的生物电化 学传感器时，加入同样浓度的VB2样品，并使用同样的电流信号记录仪记录电流响应时，检 测结果高度一致，变异系数小于9%);且该发明对于核黄素检测具有很强的专一性，当向反 应体系添加多种维生素及常见阳离子干扰物时，无明显电流变化。
[0019] 按照上述实验所使用的装置，测得VB2检测的浓度线性范围为5 nM到10 μΜ，定性 检测下限为InM。相比HPLC检测法和巧光分光光度计法等具有更宽的测量范围，可用于生化 检测、食品检测中VB2的测定。
【附图说明】
[0020] 图1为本发明的生物电化学传感器示意图； 图2添加不同浓度VB2标准溶液后的电流输出信号结果； 图3为本发明所提供的VB2检测方法测得的标准曲线； 图4当VB2浓度为5nM和lOyM时的电流输出信号结果； 图5 W碳拉为阳极材料时的电流输出信号结果； 图6当外加电压为0伏特、-0.2伏特、-0.4伏特和-1.5伏特时的电流输出信号