一种测定发酵食品中痕量氨基甲酸乙酯的方法
【技术领域】
[0001 ]本发明公开了一种测定发酵食品中痕量氨基甲酸乙醋化thyl carbamate,EC)的 方法，具体来说是设及一种基于气相色谱一串联质谱仪测定发酵食品中痕量氨基甲酸乙醋 的方法，属于食品理化指标检测技术领域。
【背景技术】
[0002] 氨基甲酸乙醋，又称尿烧，广泛存在于各种发酵食品中，是一种潜在的致癌物质， 可导致肺癌、淋己癌、肝癌和皮肤癌等多种疾病，世界卫生组织国际癌症研究机构（IARC)将 其归为2A类致癌物，联合国粮农组织/世界卫生组织(FA0/WH0)食品添加剂联合专家委员会 (巧CFA)第64次会议建议，为了保障人类身体健康，应尽可能降低发酵饮料和食品中氨基甲 酸乙醋的含量。
[0003] 已经报道的氨基甲酸乙醋含量的测定主要集中于面包、酸牛奶、酱油等发酵食品 W及葡萄酒、苹果酒、中国黄酒和日本清酒等酒精饮料等食品行业，采用的方法有气相色谱 法、气质联用法、液相色谱法、液相色谱-串联质谱法、红外光谱法等。国家进出口检验检验 局针对出口的黄酒、蒸馈酒中的氨基甲酸乙醋制定了气相色谱法的检测标准（SN/T 0285- 93)，此标准采用液液萃取法，费时、费力，而且检测时采用外标法，存在定量不够准确等缺 点，因此，随着前处理和检测技术的提高，此行业标准也亟需进一步的优化和改进。
[0004] 现有研究结果表明，氨基甲酸乙醋是一种多位点致癌物，可导致肺癌、肝癌、皮肤 癌和淋己癌等多种癌症，在生物体内的代谢途径主要有两条，一条是醋酶代谢，另一条主要 与细胞色素 P450有关，进入生物体后，约0.5%左右的氨基甲酸乙醋被细胞色素 P450氧化为 乙締基-氨基-甲酸乙醋，随后形成乙締基-氨基-甲酸乙醋环氧化物，该种环氧化物在体内 形成DNA加聚物，造成DNA双链损坏，从而导致细胞癌变，约0.1 %的氨基甲酸乙醋被细胞色 素 P450氧化后形成的物质能够导致DNA双链复制时错配，从而造成基因的严重缺失或突变。 因此，自上世纪六屯十年代发现在发酵食品及酒精饮料中含有氨基甲酸乙醋W来，许多文 献都报道了酒精饮料及发酵食品中氨基甲酸乙醋含量的检测方法。
[0005] 无论是国外还是国内的研究者，建立的分析方法多为气相色谱/质谱联用，或者是 液相色谱-巧光检测器法。由于氨基甲酸乙醋的含量一般为卵m甚至卵b级别，含量较低，且 酒精饮料或者发酵食品的成分较为复杂，基质干扰非常严重，因此，试样都需经过复杂的前 处理W及衍生化过程。气相色谱/质谱联用法一般是采用两种或两种W上不同类型的固相 萃取小柱或者固相萃取与基质分散萃取相结合对样品进行净化，然后使用大量的溶剂洗脱 萃取液中的氨基甲酸乙醋，洗脱液浓缩后再行测定，实验中使用大量的有机溶剂，分析成本 较高，且耗时繁琐，难W实现大量样品的批量测定。采用液相色谱-巧光检测器法时，试样需 经过衍生化过程，反应要求在酸性，且在避光条件下进行，更为重要的是，该方法的重复性 和准确度不够高，可用于样品的筛查，但难W实现对样品中氨基甲酸乙醋的准确测定。
[0006] 液相色谱-串联质谱法化PLC-MS/MS)、气相色谱-串联质谱法(GC-MS/MS)是近年来 发展起来的一种色谱/质谱联用技术。两种方法由于具有样品前处理简单、操作方便、清洁 实验等明显优势，已广泛应用于环境监测、化工、冶金、地质、水文、±壤、电子工业、食品饮 料、临床化验等科学研究领域。在发酵食品及酒精饮料中EC的测定领域，研究者也尝试采用 运两种分析技术建立了检测方法。为此，本专利创新采用GC-MS/MS对发酵食品中痕量氨基 甲酸乙醋行量化分析。
【发明内容】
[0007] 本发明旨在克服现有的技术缺陷，提供一种采用气相色谱-串联质谱仪测定发酵 食品中痕量氨基甲酸乙醋含量的方法，该方法能准确检测发酵食品中痕量氨基甲酸乙醋的 含量，测定结果准确、灵敏度高，基质干扰少。
[0008] 具体来说，本发明采用了 W下技术方案：
[0009] -种测定发酵食品中痕量氨基甲酸乙醋的方法，其特征在于，所述方法包括W下 步骤：
[0010] (1)内标溶液的制备：WD5-氨基甲酸乙醋D5-EC为内标物，使用乙腊为溶剂，制备 内标溶液；
[0011] (2)标准工作溶液的制备氨基甲酸乙醋EC标准品为目标物，使用乙腊为溶剂， 经逐级稀释制备成标准储备溶液，然后分别加入一定量的内标溶液，制备成标准工作溶液；
[0012] (3)样品溶液的制备:准确称取一定质量的食物样品，加一定体积的水进行超声萃 取，得到萃取液;然后使用C18固相萃取柱进行净化，得到净化液;再W二氯甲烧为溶剂，使 用娃藻±固相萃取柱对净化液进行反萃取，得到淋洗液;最后对淋洗液进行浓缩，得样品溶 液；
[OOU] (4)气相色谱-串联质谱仪分析：用气相色谱-串联质谱仪GC-MS/MS对标准工作溶 液和样品溶液进行检测分析；
[0014] (5)标准工作曲线的绘制及样品结果的计算。
[0015] 在W上方法中，所述的内标溶液的制备包括W下步骤：
[0016] (1)内标储备液:准确称取0.5g D5-EC，精确至0.1 mg，于lOOmL的容量瓶中，用乙腊 溶解并定容至刻度；
[0017] (2)内标溶液:准确移取O.lmL内标储备液，于lOOmL的容量瓶中，用乙腊稀释并定 容至刻度。
[0018] 另外，所述的标准工作溶液的制备包括W下步骤：
[0019] (1)-级标准储备液:准确称取0.5g EC，精确至0.1 mg，于lOOmL的容量瓶中，用乙 腊溶解并定容至刻度；
[0020] (2)二级标准储备液:准确移取O.lmL-级标准储备液，于lOOmL的容量瓶中，用乙 腊稀释并定容至刻度；
[0021] (3)标准工作溶液:分别准确移取二级标准储备液15化、3化L、60化、120化、240化、 480化和96化L，至lOOmL的容量瓶中，再分别准确加入5(Κ)化内标溶液，用乙腊稀释并定容至 刻度，得系列标准工作溶液。
[0022] 进一步，所述的样品溶液的制备包括W下步骤：
[0023] (1)样品萃取:准确称取lOg食物样品，于100血锥形瓶中，并加入40血超纯水和200 化内标溶液，使用縱满混合器将样品分散均匀，再置于超声波发生器内超声萃取20min，得 到萃取溶液；
[0024] (2)萃取液净化:预先对规格为2g/10mL的C18SPE小柱进行活化，即先加入lOmL甲 醇，抽干，然后再加入lOmL超纯水，快速抽下，并使C18小柱上筛板留有少量水，待准备好 C18SPE小柱后，移入lOmL萃取液，使其保持1滴/秒左右的速度滴下，待小柱上筛板留有少量 溶液时，再加入lOmL混合溶剂9mL超纯水+lmL甲醇进行淋洗，使其保持1滴/秒左右的速度滴 下，收集淋洗液，视为净化液；
[0025] (3)净化液反萃取:预先对填料为20g的娃藻±SPE小柱进行活化，即移入50mL二氯 甲烧进行淋洗活化，尽量抽干，待SI^小柱准备好后，将上述净化液全部移入SPE小柱，用一 浓缩瓶接收淋洗液;然后再用70mL二氯甲烧多次对小柱进行淋洗，依靠二氯甲烧密度比水 大的特征，自行滴下，收集所有留下来的液体，视为淋洗液；
[00%] (4)淋洗液浓缩:在55°C、常压条件下，对淋洗液浓缩到ImL左右，得到样品进样溶 液。
[0027]其中，所述的GC-MS/MS分析，其仪器分析条件为:采用规格为30m X 0.25mm X 0.25μ m的HP-INNOWAX毛细管色谱柱;载气为氮气，恒流速度为1. OmL/min;进样方式:进样量为化 L，脉冲不分流，进样脉冲压力为25psi，时间为Imin;进样口溫度为240°C ;传输线溫度为260 °C ;升溫程序为初始溫度为50°C，W5°C/min的速率升高至150°C，再Wl0°C/min的速率升高 至 240°C，保持 5min，
[00%]其质谱分析条件为：电离方式为EI源，正离子模式;离子源溫度:230°C ;四极杆溫 度:均为150°C ;碰撞气:氮气，流速1.5mL/min，载气氮气流速为2.25mL/min;多反应监测MRM 模式，详细参数列于下表：
[0029] 目标物的MRM参数情况
[0030]
[0031] 进一步在W上方法中，所述的标准曲线绘制及结果计算如下：W标准工作溶液中 EC与D5-EC浓度之比为横坐标，W色谱图中EC与D5-EC峰面积之比为纵坐标，进行线性回归 分析，得到标准工作曲线，将相同条件下测得的样品溶液中EC与D5-EC色谱峰面积比，代入 标准工作曲线，根据下列公式求得发酵食品中痕量EC的含量：
[0032]
[0033] 式中；
[0034] W一一发酵食品中EC的含量，单位为微克每千克yg/kg;
[0035] A--EC的峰面积；
[0036] As--D5-EC的峰面积；
[0037] b一一标准工作曲线的截距；
[003引 Ms--添加内标的质量，单位为微克yg;
[0039] a--标准工作曲线的斜率；
[0040] Μ一一发酵食品的质量，单位为支。
[0041] 有益效果:本发明的检测方法对样品处理方法及色谱质谱分析条件进行了优化确 认。与现有技术相比，本发明具有如下优良效果：
[0042] (1)本发明方法创新使用气相色谱-串联质谱仪测定发酵食品中痕量EC的含量，解 决了发酵食品中EC水平低，W及复杂基质对目标物的分析干扰严重等因素的影响。
[0043] (2)本发明方法针对EC极性较强的特