联苯菊酯的快速金标试纸条及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种联苯菊酯的快速金标试纸条及其制备方法，属于农药残留免疫分析技术领域。
【背景技术】
[0002]联苯菊酯(bifenthrin)又名天王星、虫螨灵、毕芬宁，是由FMC公司研制开发的一种拟除虫菊酯类杀虫、杀螨剂，除对鳞翅目幼虫、蚜虫、粉虱、植食性叶螨等20多种农业害虫有较好防效外，还对卫生害虫白蚁有强烈的驱避及毒杀作用。联苯菊酯对鱼类及家蚕高毒，对蜜蜂中毒，但该药在水中溶解度很低(I mg/L)，且能较好的吸附于土壤颗粒表面，因此对环境造成的危害较小。联苯菊酯具有作用迅速、残效期长、在土壤中不移动等优点，作为一种理想的白蚁防治毒土处理药剂，被广泛应用于我国新建房屋的白蚁预防。
[0003]目前，对农药残留的检测方法主要是仪器分析方法和酶联免疫分析方法(ELISA)等。仪器分析方法包括高效液相色谱法(High performance liquid chromatography ,HPLC)、气相色谱法(Gas chromatography，GC)、薄层色谱法(Thin layer chromatography,TLC)、液-质串联法(HPLC-MS)和气-质串联法(GC-MS)等，这些仪器分析方法虽然可以达到较高的检测灵敏度，但需要复杂昂贵的仪器设备及专业操作人员，加之样品前处理繁琐费时、检测费用高，难以满足快速、在线检测的需要。ELISA(Enzyme Linked ImmunosorbentAssay)方法是常用的免疫检测方法，但是其却有操作步骤相对较多，检测时间较长，检测结果不够直观，不能在线进行检测等缺陷。因而ELISA在联苯菊酯的现场快速检测及施药量控制上的应用受到很大的限制。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是克服现有技术中存在的不足，提供一种联苯菊酯的快速金标试纸条及其制备方法，该金标试纸条具有特异、敏感、快速、简便的优点。
[0005]按照本发明提供的技术方案，所述联苯菊酯的快速金标试纸条，包括衬板，其特征是:在所述衬板上依次排列样品垫、金标结合垫、纤维素膜和吸水垫，金标结合垫内吸附联苯菊酯金标抗体，纤维素膜上设有隐形检测线和隐形对照线，隐形检测线采用联苯菊酯半抗原偶联的载体蛋白溶液印制，隐形对照线采用兔抗鼠IgG抗体印制。
[0006]进一步的，所述联苯菊酯半抗原偶联的载体蛋白溶液采用的载体蛋白为牛血清白蛋白BSA、鸡卵清白蛋白OVA或人血清白蛋白HAS。
[0007]进一步的，在所述样品垫外部包裹样品浸入端保护膜，在吸水垫外部包裹手柄端保护膜。
[0008]进一步的，在所述样品浸入端保护膜上设有标识线。
[0009]进一步的，所述标识线位于偏向样品垫一侧约0.5厘米处。
[0010]进一步的，所述隐形检测线靠近样品垫一侧设置，隐形对照线靠近吸水垫一侧设置。
[0011]进一步的，述联苯菊酯金标抗体为胶体金标记的联苯菊酯单克隆抗体，该单克隆抗体由保藏编号为CCTCC N0.C2014135的杂交瘤细胞株所分泌。
[0012]所述联苯菊酯的快速金标试纸条的制备方法，其特征是，包括以下步骤:
(1)联苯菊酯半抗原的合成；
(2)联苯菊酯半抗原与载体蛋白偶联得到联苯菊酯半抗原偶联的载体蛋白溶液；
(3)联苯菊酯金标抗体的制备；
(4)金标结合垫的制备；
(5)兔抗鼠IgG抗体的制备；
(6)联苯菊酯半抗原偶联的载体蛋白溶液和兔抗鼠IgG抗体包被纤维素膜；
(7)试纸条的组装。
[0013]进一步的，所述步骤(4)金标结合垫的制备:将载体蛋白溶液以8μ?/cm的量喷在金标结合垫上，42 °C干燥50 min后，再把金标记抗体以7 μ?/cm的量喷在金标结合垫上，干燥箱42 °C干燥50 min，真空干燥保存。
[0014]进一步的，所述步骤(6)具体为:把联苯菊酯半抗原偶联的载体蛋白溶液以1.2 μ1/cm的量喷在纤维素膜的下侧，作为检测线;把兔抗鼠IgG以1.2 μ?/cm的量喷在纤维素膜的上侧，作为对照线。
[0015]本发明具备以下优点:
(I)特异性强，敏感性高:本发明所述金标试纸条以胶体金标记高亲和力的单克隆抗体为基础制备而成，金标抗体中的胶体金颗粒与抗体分子之间无共价键，两者通过异性电荷间的范德华力相结合，胶体金的标记对单克隆抗体的特异性和亲和力影响很小，而且有较高的标记率。因此，试纸条很好的保留了单克隆抗体的特性，具有较强的特异性和较高的敏感性，检出最低限量为7.5 mg/L O
[0016](2)简便、快速:在使用本发明所述金标试纸条时，无需任何其他辅助仪器，可现场操作，只要将检测样加入样品垫，在5至10分钟内即可判定检测结果。
[0017](3)结果显示形象、直观、准确:本发明所述金标试纸条的检测结果以纤维素膜上的显色情况来判断。如果样品中有待测物时，待测物和金标抗体结合形成抗原一金标抗体复合物，并且继续上移，遇隐形检测线不显色或者显色很弱即表示检测样品阳性或者弱阳性;如果样品中没有待测样品时，金标抗体继续上移，遇隐形检测线显示一条清晰红线即表示检测样品阴性。隐形对照线颜色的有或无表示此试纸条的有效或无效。结果判定形象、直观、准确、简单明了。
[0018](4)节省费用，适用范围广，便于推广:使用本发明所述金标试纸条进行检测，比使用仪器和ELISA试剂盒检测进行检测的费用大幅降低。再者，试纸条的使用范围广，可满足不同层次人员的需要，便于推广应用，具有广阔的市场前景和明显的经济和社会效益。
[0019](5)本发明所述的联苯菊酯胶体金试纸条，无需专业操作人员及任何辅助类仪器，根据反应所显现的条带几分钟内即可判定结果，不仅操作简便、快速、结果直观准确、成本低，并且可以在室外进行检测。
【附图说明】
[0020]图1为本发明所述联苯菊酯的快速金标试纸条的示意图。[0021 ]图2为本发明所述联苯菊酯的快速金标试纸条的剖视图。
[0022]图3A?图3E为联苯菊酯快速检测试纸条结果判定示意图，其中:
图3A为阴性样品检测结果，图3B为弱阳性样品检测结果，图3C为强阳性样品检测结果，图3D和图3E为试纸条失效。
【具体实施方式】
[0023]下面结合具体附图对本发明作进一步说明。
[0024]如图1?图2所示:本发明所述联苯菊酯的快速金标试纸条包括衬板1、样品垫2、金标结合垫3、纤维素膜4、隐形检测线5、隐形对照线6、吸水垫7、样品浸入端保护膜8-1、手柄端保护膜8-2、标识线9等。
[0025]实施例1:
一种联苯菊酯胶体金快速检测试纸条，所述试纸条含有衬板I和依次排列在衬板上的样品垫2、金标结合垫3、纤维素膜4和吸水垫7，所述衬板I为不吸水的韧性材料，所述的韧性材料用硬质塑胶条制成，所述金标结合垫3内吸附有联苯菊酯金标抗体，所述纤维素膜4上有隐形检测线5和隐形对照线6，所述隐形检测线5用联苯菊酯半抗原偶联的载体蛋白溶液印制，所述隐形对照线6用兔抗鼠IgG抗体印制。所述吸水垫7为吸水能力较强的吸水滤纸或滤油纸。联苯菊酯金标抗体为胶体金标记的联苯菊酯单克隆抗体。偶联联苯菊酯半抗原的载体蛋白为牛血清白蛋白BSA。在试纸条的吸水垫上设有手柄端保护膜8-2，在样品垫2上设有样品浸入端保护膜8-1。所述的保护膜为不透明的胶膜，样品垫2、金标结合垫3对应的保护膜上印制有待测样品标记线，该标记线偏向样品垫一侧约0.5厘米处。
[0026]样品垫2用玻璃纤维棉制成。纤维素膜为硝酸纤维素膜。
[0027]实施例2:
与实施例1基本一样，区别在于，所述的韧性材料用不吸水硬纸条制成，所述吸水垫7为吸水能力较强的滤油纸。偶联联苯菊酯半抗原的载体蛋白为鸡卵清白蛋白0VA。样品垫2用尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜和聚酯膜制成。纤维素膜为纯纤维素膜。
[0028]实施例3:
与实施例1基本一样，区别在于，所述的韧性材料用硬质塑胶条制成，吸水垫7为吸水能力较强的吸水滤纸。偶联联苯菊酯半抗原的载体蛋白为人血清白蛋白HAS。样品垫2用聚偏二氟乙烯膜和聚酯膜制成。纤维素膜为羧化纤维素膜。
[0029]实施例4:一种联苯菊酯的快速金标试纸条的制备方法，包括以下步骤:
(I)、联苯菊酯半抗原的合成:
①联苯菊酯半抗原LBc的合成:称取0.99 g(5 mmol)联苯醇于50 mL圆底烧瓶中，加入10 mL无水卩比啶和1.0 g(10 mmol) 丁二酸酐，50°C避光条件下，磁力搅拌反应12 h;向反应溶液中加入10 mL 3.6%&%)盐酸，继续反应0.5 h;转移反应溶液至250 mL分液漏斗，乙酸乙酯萃取两次(20 mLX2)，水洗两次(15 mL X 2)，饱和NaCl水溶液洗一次(10 mL);有机相经无水硫酸钠干燥后，减压蒸发浓缩近干，重结晶，得到白色固体。
[°03°] ②联苯菊酯半抗原LBy的合成:取1.4g联苯醉于100 mL三口烧瓶中，加入0.98g18-冠醚-6，加入20 mL丙酮溶解，冷却，在冰浴条件下，将2.Sg高锰酸钾研细后的粉末分批加入，搅拌反应5h;将反应后的混合物抽滤，并用少量丙酮洗滤饼，滤饼风干后，放入研钵内，加入适量的饱和NaHCO3，研磨，使可溶性部分充分溶解，过滤除去MnO2，滤液用浓盐酸调节pH值为2.0左右，乙醚提取，水洗，无水Na2SO4干燥，浓缩近干;采用柱层析法纯化，分别用抓仿:石油醚(20:80)、氯仿进行梯度淋洗，收集氯仿部分，浓缩后得到白色晶体。
[0031](2)、联苯菊酯半抗原与载体蛋白偶联:
利用活泼酯法(Active Ester method，简称AE法)将具有羧基末端(-C00H)的半抗原偶联到大分子的蛋白质上。分别称取0.1 mmol半抗原与0.1 mmol NHS，用600 μ? DMF溶解于反应装置中；称取0.1 mmol DCC，用400 μ? DMF溶解;将DCC/DMF溶液缓慢滴加到上述反应装置中；在磁力搅拌下室温密封反应7小时；反应终液置4 °(:冰箱冷却2小时以上，经8000rpm离心5分钟，取上清活泼酯液缓慢地加入到5 ml 15 mg/ml的BSA蛋白中，反应在磁力搅拌下室温搅拌4小时；待反应完成后，将反应液置于透析袋内，于0.02 mo I/L pH6.8的PB缓冲液中4 °(:搅拌透析，每四小时换一次透析液，共透析60小时;透析结束后将透析袋中的液体取出，经4 0C12000 rpm离心5分钟，取上清分装保存于-20 °(:冰箱中。
[0032]同上述方法，用OVA或HAS代替B