一种皮质酮含量测定试剂盒及其方法

文档序号:9863671阅读:1814来源:国知局
一种皮质酮含量测定试剂盒及其方法
【技术领域】
[0001 ]本发明属于生命科学领域领域,涉及一种试剂盒,具体涉及一种皮质酮含量测定试剂盒及其方法。
【背景技术】
[0002]皮质酮(CORT)是小分子抗原,在酶联免疫吸附实验中,不易直接包被于微孔板底部。目前市面上皮质酮酶联免疫吸附法检测试剂盒有直接竞争法、间接竞争法、双抗体夹心法等类型试剂盒,并且对样本来源有区分。
[0003]但是目前现有的这些皮质酮酶联免疫吸附法检测试剂盒存在有以下几种问题:
1、种类多种,给客户选择增加疑惑,而针对小分子半抗原,本身比较适合的方法就是竞争法。
[0004]2、样品来源限制性,比较若一抗是鼠抗,样品来源于鼠,通过HRP标记的抗鼠的二抗作用就会产生假阳性结果。
[0005]3、成本高,若选择包被抗体的方法,则浪费抗体,并且酶标抗原也会增大成本。

【发明内容】

[0006]为了克服现有技术的缺陷,本发明旨在提供一种皮质酮含量测定试剂盒及其方法,可快速准确的测算出皮质酮的含量。
[0007]为实现上述技术目的,达到上述技术效果,本发明通过以下技术方案实现:
一种皮质酮含量测定试剂盒,包括以下试剂:
皮质酮(CORT )标准品,0.5mg X I支,4 °C保存;
I倍稀释液(I XDilut1n buffer),20mLX 3瓶,4°C保存,由I3BS缓冲溶液组成;
50倍浓缩洗涤液(50 XWashing buffer),20mLX I瓶,4°C保存,由I3BST缓冲溶液组成; 一抗,1.5mL X I支,由皮质酮(CORT)—抗组成;
酶标二抗,1.5mL X I支,由HRP标记山羊抗小鼠二抗组成;
TMB显色液,12mL;
终止液(Stop solut1n),6mLX I瓶,4°C保存,由硫酸组成。
[0008]进一步的,所述的I倍稀释液中,?85缓冲溶液的?!1=7.4,物质的量浓度为0.0现;
进一步的,所述的50倍浓缩洗涤液中,PBST缓冲溶液由50mL,pH=7.4,物质的量浓度为
0.0lM的PBS缓冲溶液与2mL tween-20配制而成;
进一步的,所述一抗,皮质酮一抗的体积为45yL ;
进一步的,所述酶标二抗中,HRP标记山羊抗小鼠二抗的体积为30yL;
进一步的,所述终止液中,硫酸的物质的量浓度为2M。
[0009]本试剂盒应用间接竞争法测定标本中皮质酮(CORT)水平。用纯化的皮质酮(CORT)标准品包被微孔板,制成固相抗原。样品中皮质酮与固相抗原竞争抗体,再利用HRP标记的二抗催化底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的皮质酮(CORT)呈负相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),通过标准曲线计算样品中皮质酮(CORT )浓度。
[0010]—种基于酶联免疫吸附实验测定组织、血清、血浆及相关液体样本中皮质酮(CORT )含量的方法,包括以下步骤:
步骤I样本的前处理;
1)血清:血液室温自然凝固90分钟,在转速为3000转/分下,离心10分钟,收集上清,保存过程中如出现沉淀,应再次离心;每次实验前,样品使用10倍体积的甲醇沉淀蛋白,在转速为3000转/分下,离心10分钟,取上清,氮气吹干,20yL甲醇复溶;实验时,用所述稀释液(dilut1n buffer)稀释甲醇复溶后的样品;
2)血浆:应根据标本的要求选择EDTA、柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂,混合10-20分钟后,在转速为3000转/分下,离心10分钟;仔细收集上清,保存过程中如有沉淀形成,应该再次离心;每次实验前,样品使用10倍体积的甲醇沉淀蛋白,在转速为3000转/分下,离心10分钟,取上清,氮气吹干,20yL甲醇复溶,实验时,用所述稀释液(dilut1n buffer)稀释甲醇复溶后的样品;
3)尿液:用无菌管收集,在转速为3000转/分下,离心10分钟,收集上清;保存过程中如有沉淀形成,应再次离心;胸腹水、脑脊液参照实行;每次实验前,样品使用10倍体积的甲醇沉淀蛋白,在转速为3000转/分下,离心10分钟,取上清,氮气吹干,20yL甲醇复溶,实验时,用所述稀释液(dilut1n buffer)稀释甲醇复溶后的样品;
4)细胞培养上清:检测分泌性的成份时,用无菌管收集,在转速为3000转/分下,离心10分钟,仔细收集上清;检测细胞内的成份时,用pH=7.2-7.4的PBS缓冲溶液稀释细胞悬液,使细胞浓度达到100万/mL左右;通过反复冻融,以使细胞破坏并放出细胞内成份;在转速为2000-3000转/分下,离心20分钟左右,仔细收集上清;保存过程中如有沉淀形成,应再次离心;每次实验前,样品使用10倍体积的甲醇沉淀蛋白,在转速为3000转/分下,离心10分钟,取上清,氮气吹干,20yL甲醇复溶,实验时,用所述稀释液(dilut1n buffer)稀释甲醇复溶后的样品;
5)组织标本:称取组织Ig,加入ImL,pH=7.4的PBS缓冲溶液,充分研磨;在转速为3000转/分下,离心10分钟,收集上清;每次实验前,样品使用10倍体积的甲醇沉淀蛋白,在转速为3000转/分下,离心10分钟,取上清,氮气吹干,20yL甲醇复溶,实验时,用所述稀释液(dilut1n buffer)稀释甲醇复溶后的样品;
步骤2标准品的稀释与加样;
I)用甲醇作为溶剂将皮质酮标准品配制成5mg/mL的标准品母液,根据实验使用量用该试剂盒中的所述稀释液(dilut1n buffer)将所述母液稀释1000倍,使其浓度达到5yg/mL(先稀释100倍,再稀释10倍),并再将其稀释成64yg/L作为标准液;
2 )设置浓度分别为 64yg/L,32yg/L,16yg/L,8yg/L,4yg/L,2yg/L 的标准曲线;
3)标准曲线每个浓度设置两个重复,浓度稀释采用倍比稀释法,分别取五支EP管,各加入20(^1^所述稀释液(dilut1n buffer),取200yL的64yg/L标准液加入到第一根EP管混勾成32yg/L标准液,再从其中取出200yL的32yg/L标准液加入到第二根EP管混匀成16yg/L标准液,以此类推,再从其中取出200yL的16yg/L标准液加入到第三根EP管混匀成8yg//L标准液,再从其中取出200yL的8yg/L标准液加入到第四根EP管混匀成4yg/L标准液,再从其中取出200yL的8yg/L标准液加入到第五根EP管混匀成2yg/L标准液;从而得到64yg/L,32yg/L,16yg/L,8yg/L,4yg/L,2yg/L这6个浓度梯度的标准液;
步骤3样品与抗体预结合;
用0.2%0VA将所述一抗稀释125倍,并且再取5根EP管,分别设为标准孔、待测样品孔、空白孔和对照孔;
标准孔:分别取130yL上述6个浓度梯度的标准液与等体积稀释后的抗体混合;
待测样品孔:取130μ1样品与等体积稀释后的所述一抗混合。
[0011 ]空白孔:取26(^1^所述稀释液(dilut1n buffer);
对照孔:取130yL所述稀释液(dilut1n buffer)与等体积稀释后的抗体混合;
将上述标准孔、待测样品孔、空白孔和对照孔的各EP管进行室温摇床预温育40分钟; 步骤4温育;
将上述预温育的标准孔、待测样品孔、空白孔和对照孔的各EP管混匀后,分别取各EP管中10yL的物质加入到酶标板对应孔中,用封板膜封板后置37°C温育90分钟;
步骤5洗涤;
将所述的50倍浓缩洗涤液(washing buffer)用蒸馈水50倍稀释后备用,弃酶标板中液体,吸水纸上拍干,每孔加入300yL所述浓缩洗涤液,停留I分钟,弃液体,拍干;重复4次;步骤6加酶标二抗;
400倍稀释所述酶标二抗,每孔加入10yL,用封板膜封板后37 °C温育60分钟;
步骤7 二次洗涤;
将所述的50倍浓缩洗涤液(washing buffer)用蒸馈水50倍稀释后备用,弃酶标板中液体,吸水纸上拍干,每孔加入300yL所述浓缩洗涤液,停留I分钟,弃液体,拍干;重复4次;步骤8显色;
每孔分别加入10yL所述TMB显色液,混匀,37 °(:避光显色15-20分钟;
步骤9终止;
每孔分别加50yL所述终止液,终止反应(此时蓝色立转黄色);
步骤1测定;
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