一种重组人ii型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白浓度测定方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体地涉及一种人血清中重组人肿瘤坏死因子受 体-抗体融合蛋白浓度测定方法。
【背景技术】
[0002] 肿瘤坏死因子（tumour necrosis factor, TNF)，又叫恶病质因子 kachectin)， 按其结构分两型；TNF- α和TNF- β，其中由活化的巨瞻细胞、单核细胞和T细胞产生 的能使肿瘤坏死的因子称为TNF-a ;而把由活化的Τ细胞和ΝΚ细胞产生的淋己毒素 (lymphotoxin，LT)称为TNF-目。目前研究较多的是TNF-a，它是一种由157个氨基酸组 成、相对分子质量为17kD的可溶性多肤，成熟型TNF-a的活性形式为Η聚体。
[0003] TNF- α具有广泛的生物学活性，对免疫细胞有活化、促增殖和分化等作用，例如： 参与淋己细胞的迁移、活化、增殖与分化W及淋己组织的再生，对某些非肿瘤细胞和大多数 肿瘤细胞具有诱导调亡的作用，具有强大的抗肿瘤作用，是迄今发现的抗瘤作用最强的细 胞因子，对肿瘤细胞具有直接的抑制增殖和细胞坏死作用。TNF-a对其他细胞（包括必肌 细胞）的生长分化也有影响，同时还有抗病毒及细菌，激活T细胞，促进IL-1、比-2、IL-6的 产生及分泌，诱发炎症反应，促进IL-2R、EGFR等的表达等功能，在宿主防御反应中起重要 作用。TNF-a具有双重生物学效应，在浓度较低时，TNF-a主要作为白细胞和内皮细胞的 自分泌及旁分泌的调节物，参与抵抗细菌、病毒和寄生虫的感染，促进组织修复及调节炎症 反应，引起肿瘤细胞调亡等；在高浓度时，过量的TNF-a在体内的大量产生和释放则会破 坏机体的免疫平衡，与其他炎症因子一起产生多种病理损伤。TNF-a对众多的组织器官产 生生物学效应，是细胞因子网络中一个重要的多功能成员，是机体维持内部自稳、抵御各种 致病因子必不可少的免疫调节因子。
[0004] TNF-a参与机体的多种病理生理过程，包括发热、炎症、创伤愈合、免疫调节、病毒 复制、变态反应、膜岛素抵抗和肿瘤杀伤等。当机体处于病理状态时，TNF-a对清除受损细 胞、维持机体内环境平衡起着重要的作用，是维持机体内部稳定、抵御各种致病因子必不 可少的免疫调节因子。肿瘤坏死因子-α生产的失调被认为与许多人类疾病有关，包括阿 兹海默氏症、癌症、重性抑郁障碍和肠炎。在某些免疫性疾病如；中重度类风湿关节炎、强直 性脊柱炎、中重度寻常型银屑病中，肿瘤坏死因子-α水平升高，引起炎症反应。炎症得不 到有效治疗，疾病就会发展，最终会造成骨和关节的破坏，W及银屑病皮损迁延不愈。
[0005] TNF- α的生物学活性主要是通过细胞膜上的特异受体传递信号而实现的。TNF- α 受体灯NFR)广泛存在于肝、肺、肾、肠道及肌肉组织中。TNF-a与祀细胞膜上的TNFR结合 产生生物学效应，通过受体后效应将信息传递到胞核，使mRNA表达并进而合成蛋白质。
[0006] TNF-a受体灯NFR)有2种，即相对分子质量分别为55000的TNFR I(p55)和75000 的TNFRII (p75)，存在于多种正常及肿瘤细胞表面。两类TNFR均为糖蛋白，氨基酸顺序分 析显示两类受体胞外区域的氨基酸顺序高度相似，但胞内区域则完全不同。TNFR与TNF- α 和TNF-目的结合具有高度亲和力，其KD值均在pmol水平。由于各种细胞表达TNFR存在 差异，使得TNF-a对各种细胞的作用不同，由此表现出其功能及其程度的多样性。一般来 说，受体数目越高越容易受到TNF-a的损伤。
[0007] TNF-a等细胞因子一方面与脏器细胞膜上的受体结合产生效应；另一方面，细胞 因子与循环中的可溶性受体结合，使循环中的细胞因子减少，但在组织中的表达却增加， 其在局部中的过度生成导致脏器损害。
[0008] 重组人II型肿瘤坏死因子受体Fc抗体融合蛋白（riiTNFRII ;Fc)是一种采用基因 重组技术生产的融合蛋白，其一端为TNFRH胞外区，一端为人IgGl的Fc端。它通过与可 溶性、膜型TNF - a相结合，特异性阻断TNF - a与细胞表面受体的相互作用，阻断TNF - a 介导的炎症反应，从而治疗因 TNF-a失调所导致的类风湿关节炎、强直性脊柱炎及银屑病 等自身免疫疾病。
[0009] 现有测定人血清中重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白浓度的方法，一 般为使用测定人II型肿瘤坏死因子受体的商业化试剂盒对人血清中重组人II型肿瘤坏死 因子受体-抗体融合蛋白，其使用的稀释液均为化ISA实验常用稀释缓冲液，因此所配制出 来的标准曲线、质控样品等均不含血清成分，与所测试样品的基质相差甚远，并不能保证测 试的准确性；更糟糕的是，有的样品本身也需要使用稀释液进行稀释，如此下来则样品间基 质组分都不一致，所测试结果可信度也就大打折扣。而在某些方法中，仅仅使用人血清质控 样品及测试样品的稀释液，但由于血清中含高浓度的内源性II型肿瘤坏死因子受体，使得 实验本底很高，方法的灵敏度往往达不到要求。
[0010] 因此，一种准确测定重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白浓度的测定方 法仍是目前所急需的。
【发明内容】
[0011] 本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种准确的测定人血清样品中重 组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白浓度的方法。本发明的方法可克服方法验证 及样品检测过程中做为样品稀释液的人血清中内源性可溶II型人肿瘤坏死因子受体对待 测重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白的背景干扰，提高方法的定量灵敏度。且 本方法所使用标准曲线、质控样品及待测样品均使用同样的血清进行稀释，保证基质组分 一致。具体地，发明公开了 ：
[0012] 1、一种重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白浓度的测定方法，其特征在 于，待测样品为人血清，待测样品的稀释液为已去除内源性TNFRII的正常人血清。
[001引 2、根据上述1所述的方法，其特征在于，所述去除内源性TNFRII的正常人血清是 通过利用链霉亲和素偶联的磁珠及生物标记的抗TNFRII单克隆抗体纯化正常人血清获 得。
[0014] 3、根据上述2所述方法，其特征在于，包括如下步骤：
[001引 （1)使用生物素标记抗TNFRII单克隆抗体；
[0016] (2)使用链霉亲和素偶联的磁珠捕获步骤（1)所得的生物素标记的抗TNFRH单克 隆抗体；
[0017] (3)使用步骤（2)所得的捕获生物素标记抗TNFRn单克隆抗体的链霉亲和素偶联 的磁珠纯化正常人血清，获得去除内源性TNFRII的正常人血清；
[0018] (4)使用步骤（3)获得的去除内源性TNFRn的正常人血清作为稀释液稀释待测样 品，测定待测样品中重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白浓度。
[0019] 4、根据上述3所述方法，其特征在于，步骤（4)所述重组人II型肿瘤坏死因子受 体-抗体融合蛋白浓度是通过具有高度特异性的双特异性单克隆抗体夹必ELISA方法测 定。
[0020] 5、根据上述4所述方法，其特征在于，所述方法的标准品、质控样品及待测样品的 稀释液均是权利要求3步骤（3)所获得的去除内源性TNFRII的正常人血清。
[0021] 6、根据上述4所述的方法，其特征在于，所述重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗 体融合蛋白浓度测定还使用具备高信噪比的生物素-亲和素信号系统进行测定。
[0022] 7、根据上述3所述方法，其特征在于，所述抗TNFRII单克隆抗体是MAB726抗体。
[0023] 8、根据上述7所述方法，其特征在于，所述MAB726抗体（重量）；链霉亲和素偶联 的磁珠（体积）比为Img ;4ml。
[0024] 9、一种验证上述1-8任一所述方法的验证方法，其特征在于，所述验证包括