同时检测庆大霉素和喹诺酮类药物的量子点免疫荧光试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于食品安全检测领域，具体设及一种同时检测动物源性食品中庆大霉素 和哇诺酬类药物残留的量子点免疫巧光试剂盒。
【背景技术】
[0002] 庆大霉素(Gentamycin，GM)，是氨基糖巧类抗生素的一种，庆大霉素呈碱性、易溶 于水、性状稳定，与硫酸结合成临床上使用的硫酸庆大霉素。它的抗菌谱较广，对绿脈杆菌、 大肠杆菌、产气杆菌、克雷白杆菌、奇异变形杆菌、某些吗I噪变形杆菌、某些奈瑟菌、某些无 色素雷杆菌和志贺菌等革兰氏阴性菌有抗菌作用，而且对革兰氏阳性菌中的金黄色葡萄球 菌也有很强的抗菌作用;其抗菌作用机理是直接与30S核糖体亚单位16rRNA的解码区的A部 位结合，从而导致菌体死亡。但是，随着庆大霉素的广泛使用，一些细菌逐渐对其产生了耐 药性。虽然庆大霉素对奶牛乳房炎、子宫内膜炎等有很好的疗效，常用作兽医临床治疗及饲 料药物添加剂，但不规范用药会引起畜产品，尤其是泌乳动物的乳汁中有药物残留，对人类 的健康构成潜在危害，造成耳毒性和肾脏毒性。国内外相继规定了其在动物性食品中的最 高残留限量。我国农业部235号公告规定，庆大霉素在肌肉、脂肪中的最高残留限量为 lOOppb，在肝中的最高残留限量为2000ppb，在肾中的最高残留限量为5000ppb，在牛奶中的 最局残留限量为20化pb。
[0003] 哇诺酬类(Quinolones，QNs)，是一类人工合成的含4-哇诺酬基本结构，对细菌DNA 螺旋酶具有选择性抑制的抗生素。1962年最早的哇诺酬类药物糞晚酸首先用于临床，由于 其抗菌谱窄、口服吸收差、副作用高等原因现在已很少使用。当前应用的哇诺酬大多为含有 氣原子的氣哇诺酬类。运类药物抗菌谱广，对革兰氏染色呈阴性杆菌活性较高，对其他抗生 素耐药的德细菌也具有良好的抗菌作用，无交叉耐药性;在体内分布广，体内和组织中药物 浓度高；口服吸收好，半衰期长，使用方便;与头抱菌素类药物相比，抗菌作用相似，但价格 便宜。目前在兽医临床上常用的药物主要有诺氣沙星、氧氣沙星、恩诺沙星、环丙沙星、沙拉 沙星、氣甲哇等十几种，随着应用的增加，其各种毒副作用也逐渐显现出来，主要体现在头 晕、低血糖、恶屯、、胃肠道症状、中枢神经系统和过敏反应。特别是近几年，严重的不良反应 发生率约为1.6%~1.8%，引起了全世界的关注。为了保障动物源性食品的安全，欧盟、美国及 我国等很多国家都对哇诺酬类药物在动物源性食品中残留制定了最大残留限量(M化）。我 国农业部文件(农质发[2009]3号文件）中规定了2009年我国畜禽产品监测项目，禽肉中4种 哇诺酬类药物残留是重要的监测项目之一。
[0004] 现有的庆大霉素和哇诺酬类药物检测方法多为色谱法，但是运些方法的灵敏度受 样品的净化、浓缩等步骤的影响较大，再者运些方法需要复杂的仪器，过程繁琐，不适应现 场大量样本的筛查，且目前现有的快速检测产品存在一定的局限性，无法同时检测庆大霉 素和哇诺酬类药物的残留。量子点免疫巧光检测方法具有特异性强、稳定快速、检测范围 宽、操作简单自动化程度高、试剂稳定且有效期长(6~18个月）等优点，其检测限比化ISA和 理化检测方法高。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种同时检测庆大霉素和哇诺酬类药物的量子点免疫巧光 试剂盒，包括包被原、量子点标记的抗体； 所述包被原为庆大霉素半抗原与载体蛋白的偶联物和哇诺酬药物半抗原与载体蛋白 的偶联物的混合物； 所述的庆大霉素半抗原，为式I所示的化合物；
式I。
[0006] 所述的哇诺酬药物半抗原，为式Π 所示的化合物；
式Π 。
[0007] 本发明还公开了式Π 所示化合物的制备方法，包括如下步骤： (1) 称取环丙沙星33.3mg，溶于1.5mL去离子水中，用1M氨氧化钢溶液调pH9.0; (2) 冰浴中加入乙二醇二缩水甘油酸20化，室溫揽拌反应4h，混合液真空干燥，得到的 固体即为产物。
[0008] 本发明提供的庆大霉素抗原，是将式I所示化合物和载体蛋白偶联得到的偶联物。
[0009] 常用载体蛋白均可采用，如牛血清白蛋白（BSA)，卵清蛋白（OVA)，人血清白蛋白 (HSA)，鼠血清白蛋白（MSA)，甲状腺蛋白（TG)或血蓝蛋白化LH)等，庆大霉素与BSA的摩尔结 合比具体可为8:1。
[0010] 本发明还公开了所述庆大霉素抗原制备的方法，包括如下步骤： (1) 取26mg庆大霉素，溶于4ml碳酸盐缓冲液（取63.6mg无水化0)3和117.6mg化肥化， 用纯水定容至20mL); (2) 取BSA 60mg，溶于6ml所述碳酸盐缓冲液； (3) 将步骤（1)得到的庆大霉素溶液加到步骤(2)得到的BSA溶液中并室溫混匀lOmin， 然后加入487yl 1%(体积比）戊二醒水溶液并室溫揽拌过夜，然后加入化BH4溶液（5mg Na册4溶于50化1纯水)并室溫揽拌比，然后用纯水透析，再然后用PBS缓冲液(pH7.2、0.01M) 进行透析，然后4500巧m离屯、6min并取上清液。
[0011] 本发明提供的哇诺酬药物抗原，是将式π所示化合物和载体蛋白偶联得到的偶联 物，环丙沙星与BSA的摩尔结合比具体可为7:1。
[0012] 本发明还公开了所述哇诺酬药物抗原制备的方法，包括如下步骤： (1) 取11.3mg半抗原溶于1血0.1Μ碳酸钢缓冲液； (2) 逐滴加入牛血清白蛋白溶液巧Omg牛血清白蛋白溶于5mL0.1M碳酸钢缓冲液）； (3) 室溫揽拌过夜后装入透析袋，PBS 4度透析72小时，期间换透析液6次。将透析液在 无菌条件下过0.22 Ml孔径的滤膜，分装于安培瓶中，-20度保存。
[0013] 所述庆大霉素抗原、哇诺酬药物抗原可W作为免疫原制备相应的特异性抗体，也 可W作为包被原制备量子点免疫巧光微孔板。
[0014] 所述检测抗体为庆大霉素的特异性抗体和哇诺酬药物的特异性抗体的混合物。
[0015] 所述庆大霉素的特异性抗体为所述庆大霉素药物的单克隆抗体;所述哇诺酬药物 的特异性抗体为所述哇诺酬药物的单克隆抗体，具体可为对11种哇诺酬类化合物(恩诺沙 星、氧氣沙星、环丙沙星、诺氣沙星、达氣沙星、氣甲哇、嗯哇酸、麻保沙星、氨氣沙星、培氣沙 星、依诺沙星)都有交叉反应的环丙沙星单克隆抗体。
[0016] 本发明还公开了应用庆大霉素抗原、哇诺酬药物抗原和庆大霉素特异性抗体、哇 诺酬药物特异性抗体制备得到的量子点免疫巧光酶联免疫试剂盒，包括量子点标记的所述 抗体。
[0017] 庆大霉素特异性抗体的量子点标记物和环丙沙星特异性抗体的量子点标记物的 制备方法均如下： ① 取2.5mg量子点，用抑4.7、0.1M的MES缓冲液洗涂，然后用1ml pH4.7、0.1M的MES缓冲 液重悬，加入0.96mg EDC和1.15mg N服，37°C反应30分钟，20000巧m离屯、5min，收集沉淀，即 为活化后的量子点； ② 取步骤①得到的活化后的量子点，用pH8.5、50mM的棚砂缓冲液洗涂，然后将2.5mg活 化后量子点、所述抗体(蛋白质含量为〇.15mg)和抑8.5、50mM的棚砂缓冲液混匀（总体积为 0.81111)，25°(3反应3.5小时； ③ 取完成步骤②的液相，加入BSA并使其质量百分含量为5%，37°C反应30分钟， 20000巧m离屯、5min，收集沉淀，用抑7.4、0.02M的PBS缓冲液洗涂，用1ml pH7.4、0.02M的PBS 缓冲液重悬； 步骤③得到的液相，用pH7.4、0.02M的PBS缓冲液稀释至65000倍体积。
[0018] 本发明还保护W上所述试剂盒在检测待测样本中是否含有庆大霉素和哇诺酬类 药物中的应用。
[0019] W上任一所述哇诺酬类可为诺氣沙星和/或恩诺沙星和/或嗯哇酸和/或环丙沙星 和/或达氣沙星和/或氣甲哇和/或洛美沙星和/或依诺沙星和/或培氣沙星和/或麻保沙星 和/或氧氣沙星。
[0020] 本发明依靠免疫学、免疫化学基本原理和残留分析技术手段，设计、合成小分子目 标分析物半抗原，并与载体蛋白偶联，制备有效人工抗原，免疫动物制备针对小分子分析物 的特异性抗体。利用抗原抗体的特异性免疫学反应，定量的检测样品中微量小分子目标分 析物。本发明提供的试剂盒能同时检测样本中是否含有庆大霉素和哇诺酬类药物，具有前 处理简单、灵敏度高、特异性强、适用范围广、操作简便(对操作人员没有专业要求）、快捷、 成本低廉、非常适合现场大批量样本的筛选，可用于专业化验、海关检疫、卫生防疫、质量监 巧。、乳业企业等，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。
【附图说明】
[0021] 图1为实施例1试剂盒检测庆大霉素含量的标准曲线。其中，横坐标为各标准品溶 液中庆大霉素浓度(yg/L)，纵坐标为百分巧光强度值(％)。
[0022] 图2为实施例1试剂盒检测环丙沙星含量的标准曲线。其中，横坐标为各标准品溶 液中环丙沙星浓度(yg/L)，纵坐标为百分巧光强度值(％)。
【具体实施方式】
[0023] W下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。W下实施例中的定量试验，均设置Ξ次重复实验，结果取平 均值。
[0024] 庆大霉素原料药:Sigma-Ald;rich，G1397。环丙沙星原料药