1 min;4000 gW上， 离屯、10 min;取50化上清即可进行分析。
[0057] 2、牛奶检测样本溶液的获得:取牛奶样本3000g W上离屯、lOmin，轻吸中间层，用 样品稀释液稀释5倍，取50μΙ即可进行分析。
[0058] 二、应用量子点免疫巧光试剂盒检测 向包被了包被原的微孔板中加入标准品溶液或待测样本溶液50化，一抗工作液50化， 室溫反应30min，弃上清，洗涂3次(每次洗涂过程均如下：每孔中加入25化L洗涂液，30秒后 弃上清），用吸水纸拍干，用巧光酶标仪检测其巧光强度数值。巧光酶标仪设置为激发波长 345nm，发射波长62化m。每个浓度的标准品溶液的发光强度的平均值(B)除W0溶液的发光 强度值(B0)，再乘W100%，即结合率。计算公式:结合率(％)=B/B0 X 100%。W标准品溶液中的 庆大霉素浓度(yg/L)的半对数值为X轴，B/B0为Y轴，绘制标准曲线图（见图1);W标准品溶 液中的环丙沙星浓度(yg/L)的半对数值为X轴，B/B0为Y轴，绘制标准曲线图（见图2)。根据 标准曲线的回归方程可W求出待测样本溶液中庆大霉素和环丙沙星的浓度。本发明中检测 结果的分析可W利用专业软件，可W实现大量样本的快速分析，整个检测过程只需60分钟 就可W完成。结合率(B/B0)为50%时对应的标准品溶液中的庆大霉素和环丙沙星的浓度即 为IC50值。根据标准曲线图，庆大霉素的IC50=2.5yg/L，环丙沙星的IC50=1.0yg/L。
[0059] Ξ、样品中庆大霉素和环丙沙星浓度的测定 用每个检测样品溶液的巧光强度平均值除W0溶液的发光强度平均值，再乘W100%，得 到抑制率。相对应每一个检测样品溶液的抑制率，则可从标准曲线上读出检测样品溶液的 半对数值，再根据样品溶液的半对数值换算出样品溶液中庆大霉素和环丙沙星的残留量， 最后再乘W各样品前处理过程的稀释倍数，即可计算出样本中庆大霉素和环丙沙星的浓 度。
[0060] 实施例4、同时检测庆大霉素和哇诺酬类药物的量子点免疫巧光试剂盒检测效果 评价 一、试剂盒灵敏度 W最低检测限作为本发明试剂盒的灵敏度指标。取20份空白样品进行检测，计算空白 样品巧光强度的平均值，并将此平均值带入标准曲线得到对应的样品浓度，计算各对应浓 度值的标准差(SD)，由平均值加 Ξ倍标准差即为该样品的最低检测限(L0D)。 结果:试剂盒检测庆大霉素的最低检测限为0.5ng/g;哇诺酬药物的最低检测限为0.3 ng/go
[0061] 二、准确度试验 向不含庆大霉素和哇诺酬类药物的猪肉、鸡肉、牛奶样品中分别添加不同浓度的庆大 霉素和环丙沙星，使庆大霉素在样品中的终浓度分别为化g/kg化）、化g/kg化），环丙沙星的 终浓度分别为化g/ kg(L)、2yg/ kg化），将添加后的样品分别按照所述方法进行前处理，得 到检测样品溶液。
[0062] 从3个不同批次的试剂盒中各抽取3个试剂盒进行检测，每个样品重复5次，分别计 算回收率。结果分别见表1-2。
[0063] 表1试剂盒的庆大霉素样本检测准确度试验结果
表1结果表明，牛奶样品庆大霉素的添加回收率在81.6%-92.1%之间；鸡肉样品的庆大 霉素的添加回收率在72.6%-90.5%之间；猪肉样品的庆大霉素的添加回收率在79.5%- 101.?)之间。
[0064] 表2试剂盒的环丙沙星样本检测准确度试验结果
表2结果表明，牛奶样品环丙沙星的添加回收率在70.4%-96.5%之间；鸡肉样品环丙沙 星的添加回收率在75.2%-94.5%之间，猪肉样品环丙沙星的添加回收率在78.9%-99.1%之 间，说明试剂盒的准确度良好。
[0065] Ξ、精密度试验 将不含庆大霉素和哇诺酬类药物的猪肉、鸡肉和牛奶样本分别按照相应方法进行处理 后获得样品溶液，添加庆大霉素和环丙沙星，使二者的终浓度都为l〇yg/kg(或yg/L)。从3个 不同批次的试剂盒中各抽取3个试剂盒（即3个酶标板），每个实验重复5次，按照试验方法获 得各样品的巧光强度值，计算变异系数。结果如表3-表5所示。
[0066] 表3牛奶的精密度试验结果(添加浓度10yg/L)
表4猪肉的精密度试验结果(添加浓度lOyg/ kg)
表5鸡肉的精密度试验结果(添加浓度l〇yg/kg)
结果表明:猪肉、鸡肉、牛奶样品的批内批间变异系数均<15%，说明试剂盒的精密性良 好。
[0067]四、试剂盒的保存期试验 试剂盒的保存条件为2-8°C，经过12个月的测定，试剂盒的最大巧光强度值(零标准）、 50%抑制浓度、庆大霉素药物和哇诺酬类药物添加实际测定值均在正常范围之内。考虑到运 输和使用过程中，会有非正常保存条件出现，将试剂盒在37°C条件下放置8天，进行加速老 化试验，结果表明该试剂盒的上述各项指标完全符合要求。考虑到试剂盒冷冻情况发生，将 试剂盒在-20°C条件下放置8天，上述各项指标完全符合要求。
[006引五、交叉反应率试验 1、在试剂盒的酶标板中每孔加入50化庆大霉素的结构类似物标准品溶液(溶剂为PBS 缓冲液，庆大霉素的结构类似物的浓度分别为0.扣g/L、1.扣g/L、4.扣g/L、13.5yg/L、40.化 g/L，将只加入PBS缓冲液的孔作为对照孔)或环丙沙星的结构类似物标准品溶液(溶剂为 PBS缓冲液，环丙沙星的结构类似物的浓度分别为0. ：3yg/L、0.化g/L、2.化g/L、8. lyg/L、 24.化g/L，将只加入PBS缓冲液的孔作为对照孔），每个浓度设置3个复孔。庆大霉素的结构 类似物和环丙沙星的结构类似物如表6所示。
[0069] 2、将采用各个浓度的结构类似物得到的对应的巧光强度值(Ξ个复孔的平均值） 除W对照孔的巧光强度值再乘W100作为纵坐标，W各个标准品溶液中的结构类似物浓度 (yg/L)的半对数值为横坐标绘制曲线图。对照曲线图，得到纵坐标数值等于50%时对应的结 构类似物浓度(yg/L)，即结构类似物的IC50值。用下式分别计算试剂盒对庆大霉素和哇诺 酬类药物结构类似物的交叉反应率，结果如表6所示。
[0070] 交叉反应率(％)=(庆大霉素的IC50值/待测药物的IC50值）X 100% 交叉反应率(％)=(环丙沙星的IC50值/待测药物的IC50值）X 100% 表6试剂盒交叉反应率
试验结果表明，本发明试剂盒对庆大霉素和哇诺酬类药物的特异性好，即本发明试剂 盒可W同时检测庆大霉素和哇诺酬类药物。
【主权项】
1. 一种同时检测庆大霉素和喹诺酮类药物的量子点免疫荧光试剂盒，包括包被原、量 子点标记的抗体。2. -种环丙沙星半抗原，为式Π 所示化合物： 式Π 。3. 本发明还公开了式Π 所示化合物的制备方法，包括如下步骤： (1) 称取环丙沙星33.3mg，溶于1.5mL去离子水中，用1M氢氧化钠溶液调pH9.0; (2) 冰浴中加入乙二醇二缩水甘油醚20yL，室温搅拌反应4h，混合液真空干燥，得到的 固体即为产物。4. 权利要求1所述包被原为庆大霉素半抗原与载体蛋白的偶联物和环丙沙星半抗原与 载体蛋白的偶联物的混合物。5. 权利要求4所述的环丙沙星半抗原与载体蛋白的偶联物的制备方法，包括如下步骤： (1)取11.3mg环丙沙星半抗原溶于lmL 0.1M碳酸钠缓冲液； (2 )逐滴加入牛血清白蛋白溶液(50mg牛血清白蛋白溶于5mL0.1M碳酸钠缓冲液）； (3) 室温搅拌过夜后装入透析袋，PBS 4度透析72小时，期间换透析液6次，将透析 液在无菌条件下过0.22 μπι孔径的滤膜，分装于安培瓶中，-20度保存。6. 权利要求4或5所述庆大霉素抗原和环丙沙星抗原在制备庆大霉素特异性抗体和环 丙沙星特异性抗体中的应用。7. 应用权利要求4或5所述庆大霉素抗原和环丙沙星抗原制备得到的量子点标记的特 异性抗体。8. 权利要求7所述抗体为庆大霉素的特异性抗体和环丙沙星的特异性抗体的混合物。9. 权利要求4或5所述抗原、权利要求7或8所述特异性抗体在检测庆大霉素和喹诺酮类 药物中的应用。10. 应用权利要求4或5所述抗原、权利要求7或8所述特异性抗体制备得到的量子点免 疫荧光检测试剂盒。
【专利摘要】本发明公开了一种同时检测庆大霉素和喹诺酮类药物的量子点免疫荧光试剂盒，同时本发明也公开了一种环丙沙星半抗原，相应的人工抗原和量子点标记的单克隆抗体的制备方法。本发明所提供的试剂盒是以庆大霉素半抗原与载体蛋白的偶联物和环丙沙星半抗原与载体蛋白的偶联物为包被原，以量子点标记的庆大霉素的特异性抗体和环丙沙星的特异性抗体的混合物为检测抗体。本发明制备方法简便可行、成本较低，半抗原产率较高，量子点免疫荧光检测试剂盒具有简单、快速、处理样品量大、灵敏度高、特异性强等诸多优点。本发明可用于食品生产企业的自我质量控制，食品安全监督和检测机构的常规筛查，还可用于科研中动物药理和毒理学研究的辅助手段。CGMCC No.840620131025
【IPC分类】C07K14/765, C07K16/44, G01N33/58, C07D405/12, G01N33/68
【公开号】CN105628929
【申请号】CN201410683323
【发明人】王文珺, 温凯, 李向梅, 陈银辉, 吴小平, 王立淼, 谢冰, 李淑芳, 潘静茹, 苏丽芳, 韩京朋, 方沅, 张璐
【申请人】北京维德维康生物技术有限公司
【公开日】2016年6月1日
【申请日】2014年11月25日