抗原检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及病毒检测技术领域，具体是一种丙型肝炎病毒NS3抗原检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 丙型肝炎是由丙型肝炎病毒化epatitis C virus,肥V)感染而引起的严重威胁人 类健康的传染性疾病。全球约有1.3-1.7亿HCV感染者，大约20 %可W自然清除，80%发展为 HCV慢性感染。10-20 %的HCV慢性感染会进一步发展为慢性进行性肝病，包括肝硬化、肝细 胞癌等。HCV是一种非甲非乙型肝炎病毒，后命名为丙型肝炎病毒，归属于肝炎病毒属 化epacivirus)，黄病毒科(Flaviviridae)。HCV病毒体呈球形，为单股正链RNA病毒。HCV- RNA全长约为9.化b，包括一个位于基因中央的开放阅读框(0RF)。该阅读框编码3000多氨基 酸的前体多聚蛋白，其通过宿主和病毒的蛋白酶作用被切割成10个具有独立功能的HCV蛋 白，根据功能的不同分别命名为核屯、蛋白Core(C)，包膜蛋白（envelope proteinHJ化1、 E2)，p7和非结构蛋白（non s1:;ruc1:ural p;rotein)NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B。NS3蛋白是 HCV病毒复制中重要的功能蛋白之一，发挥丝氨酸蛋白酶，解旋酶和ΝΤΡ酶活性，成为当今 HCV诊断，治疗和预防的研究热点。
[0003] 由于多数丙肝患者不出现明显的临床症状，大部分病人直到出现肝硬化甚至肝癌 时，才发现自己患有丙肝。因此早期诊断、早期治疗非常重要。
[0004] 目前我国阻断丙型肝炎传播的主要方法是：1、酶联免疫吸附法化LISA)检测丙型 肝炎抗体(抗-HCV)筛选供血员，然而抗-HCV的出现是在HCV感染后的6-12周(窗口期），所W 抗-HCV阴性并不能排除携带HCV具有传染性的可能，存在漏检的可能性。2、HCV-RNA检测存 在W下问题:价格昂贵，国产为200元，进口为400元。3、由于RNA易降解，易出现假阴性，因此 对样本要求高；易出现假阴性、假阳性结果，对检测人员的要求高。
[0005] 目前国内已有的丙肝抗原检测只针对核屯、抗原化CV-CAg)，HCV核屯、抗原的检测也 可缩短肥V诊断的"窗口期"，然而核屯、抗原是HCV结构区的一部分，检出率低，若能对非结构 区抗原进行联合检测，可能将提高检出率。
[0006] 血清中可存在游离的非结构蛋白NS3,其保守性相对较高，可用于血清学诊断。本 公司产品丙型肝炎病毒NS3抗原检测试剂盒(酶联免疫法），针对丙肝非结构蛋白NS3,联合上 述检测方法可W避免丙型肝炎筛查漏诊的发生，缩短窗口期，具有早期诊断丙型肝炎的临 床价值。
[0007] HCAg是HCV复制的直接指标，在血液中含量少，为了研究HCV在宿主体内有无复制， 对他人有无传染性，W及解决HCV感染的早期诊断，需要用特异性强、敏感度高的抗-HCV McAb建立敏感、特异和快速的血液中HCAg直接检测试剂。由于丙型肝炎病毒的高度变异性， 人们在设计测定丙肝抗原的试剂盒时，自然地把注意力集中在病毒基因序列相对保守的结 构蛋白核屯、抗原。因此，目前商品化的试剂盒都是针对核屯、抗原，忽略了非结构蛋白NS3抗 原作为抗原祀点的可行性。国际上美国强生公司已推出了用双抗体夹屯、法定性或定量检测 血清样品中总的或游离的HCV核屯、抗原化ISA试剂，雅培公司采用化学发光法定量检测血清 或血浆样品的HCV核屯、抗原化ISA试剂。但其试剂价格昂贵，不适合在国内普及应用。最近， 国外有报道:NS3抗原区域具有相对保守的抗原决定簇和较高的抗原性，是目前HCV抗体诊 断试剂盒的关键抗原。
【发明内容】
[0008] 有鉴于此，本发明旨在提供一种丙型肝炎病毒NS3抗原检测试剂盒。
[0009] 为达到上述目的，本发明的技术方案是运样实现的：一种丙型肝炎病毒NS3抗原检 测试剂盒，包括如下主要成分:抗HCV-NS3单克隆抗体包被板、HCV-NS3校准品、样品稀释液、 浓缩的抗体酶结合物、浓缩的抗体酶结合物稀释液、浓缩洗涂液、单组份TMB显色液、终止 液、封板膜。
[0010] 进一步地，所述抗HCV-NS3单克隆抗体包被板为两种抗HCV-NS3单克隆抗体包被的 酶标板。
[0011] 进一步地，所述浓缩的抗体酶结合物为第Ξ种抗HCV-NS3单克隆抗体与辣根过氧 化物的酶结合物。
[0012] 本发明还提供了上述丙型肝炎病毒NS3抗原检测试剂盒的检测方法，其特征在于： 包括如下步骤：
[0013] (1)准备试剂盒和待测样本，将浓缩洗涂液和浓缩的抗体酶结合物分别进行稀释；
[0014] (2)加入准备好的待测样本、HCV-NS3校准品和样品稀释液，轻轻震荡均匀，封板， 37°C振荡溫浴40min;
[0015] (3)洗板6次，拍干，加入稀释后的浓缩的抗体酶结合物，封板，37°C振荡溫浴 30min;
[0016] (4)洗板6次，拍干，加入单组份TMB显色液，封板，37°C振荡溫浴lOmin;
[0017] (5)加入终止液，lOmin内在酶标仪上ii定0D值；
[001引（6)处理数据。
[0019] 本发明还提供了上述试剂盒在检测丙型肝炎病毒中的应用。
[0020] 相对于现有技术，本发明具有W下优势：
[0021] (1)本发明应用纯化HCV基因工程表达抗原HCAg对Ba化/c小鼠进行皮下多点免疫， 共免疫3次，小鼠产生抗体滴度高达1:25600,取得了良好的免疫效果，所获的五株抗-HCV McAb只与HCV抗原蛋白产生反应，同皿V重组蛋白和大肠杆菌化-21菌体均无交叉反应，具有 良好的特异性。经鉴定，该抗体均属IgGl型，K链。
[0022] (2)本发明制备的抗-HCV McAb具有W下特点：1)纯化HCV基因工程表达抗原蛋白 效价高，纯度好，为成功免疫动物和细胞融合打下了良好的基础;2)所建立的5株单克隆杂 交瘤细胞株分泌的抗-HCV蛋白效价高，特异性良好，保存于液氮中多次复苏传代后仍能稳 定分泌抗体，用化ISA测定效价均未降低;3)所获得的抗-HCV McAb同时含有抗HCV核屯、蛋白 和非结构蛋白NS3,为建立灵敏而有较宽检测范围的HCAg检测试剂奠定了基础。
[00剖 （3)本发明通过对242份肥V-NS3抗原阳性样品的基因分型结果进行统计，化型178 份，占73.6%，2a型53份，占21.9%，3a型4份，占1.7%，3b型5份，占2.1 %，6a型2份，占 0.8%，说明本发明试剂盒可W覆盖在我国流行的HCV主要基因型。
[0024] (4)本发明在对1245例临床乙型肝炎患者血清样本的检测中，应用本发明试剂盒 测得HCV-NS3抗原阳性率为59 %，与HCV-RNA阳性重合率为80 %，与抗-HCV阳性重合率为 64%。
[0025] (5)本发明在对319名丙肝患者进行针对NS3的药物（Simprevir)疗效的对比研究 中，应用本发明试剂盒监测患者治疗效果，结果发现;丙肝患者在接受针对NS3治疗时，在监 测治疗效果方面，本发明试剂盒显示出较HCV-RNA检测方法更高的灵敏度。
【具体实施方式】
[0026] 实施例一
[0027] 单克隆抗体的制备材料与方法
[002引 1.1材料
[0029] 纯化HCV基因工程表达抗原HCAg，为中国预防医学科学院病毒学研究所提供，NS3 抗原的氨基酸位置为175-423，蛋白质1.275g/L;
[0030] RPM1640和胎牛血清购自GibcoBRLP公司；
[0031] SP2/0骨髓瘤细胞由军事医学科学院微生物流行病研究所提供；
[0032] Ba化/c小鼠购自军事医学科学院动物中屯、；
[0033] 单克隆抗体IgG亚类鉴定试剂为Sigma公司产品；
[0034] 抗-HCV ELISA检测试剂盒由本所制备；
[0035] 抗-HCV McAb分片断鉴定试剂为INN0GE肥TICS N.V.公司产品。
[0036] 1.2 方法
[0037] 1.2.1动物免疫
[0038] 取肥V重组抗原蛋白300mg/L与完全福氏佐剂等量混合制成乳化剂，共免疫Ba化/c 小鼠5只。第1次免疫l(K)yg/只，皮下多点注射，2周后用不完全福氏佐剂第2次免疫，剂量、途 径与第1次相同。2周后尾静脉取血测定效价，抗-HCV效价达1:1000~1:5000时供融合用。融 合前3d用抗原直接腹腔脾区加强免疫1次。
[0039] 采用常规间接化ISA法测定抗-HCV:包被聚苯乙締板的纯化重组HCAg浓度为5mg/ L，酶标记抗体为羊抗鼠 IgG，工作浓度为1:5000，酶标仪450皿波长测定0D值。P/N值> 2.1倍 为阳性，< 2.1倍为阴性(N值<0.05，按0.05计算）。
[0040] 1.2.2细胞融合及克隆化和腹水制备
[0041] (1)免疫脾细胞的制备
[0042] 取已免疫Ba化/c小鼠，眼球放血供检测抗体用。无菌操作取出脾脏，轻轻清洗并去 除结缔组织，置于铜网上挤压研磨，并通过网孔挤到溶液中，离屯、l〇〇〇r/min，5min，弃上清， 重悬于溶液中制成脾细胞悬液，加台吩兰染液作细胞计数。
[0043] (2)髓瘤细胞液制备
[0044] 将骨髓瘤细胞置于37°C5%C02培养箱中扩大培养。融合当天收集处于对数生长期 的SP2/0骨髓瘤细胞，离屯、lOOOr/min，5min，弃上清，重悬于液体后作细胞计数。
[0045] (3)细胞融合
[0046] 分别吸取脾细胞和骨髓瘤细胞悬液按5:1混合，置于离屯、管内充分混匀后离屯、，弃 上清，轻轻弹击管底，使沉淀细胞松散均匀成糊状。取50%的聚乙二醇(PEG)0.7mL加入混合 细胞中促进融合，严格控制作用时间在2~3min内，立即加入不完全培养液稀释，使PEG中止 作用。离屯、80化/min，7min，弃上清。加入lOmL HAT培养液制成细胞悬液，并加入已铺成饲养 细胞层的96孔板中，每孔0.1血，置37°C5%C02培养箱中培养，4~5d后换液1次，8~10加寸取 上清，用化ISA法测抗-HCV，进行初筛，阳性孔进行亚克隆。
[0047] (4)杂交瘤细胞的克隆化及腹水制备
[0048] 将96孔板中待做克隆化的杂交瘤细胞用加样器反复吹打均匀后，取少许细胞悬液 置另一无菌小瓶中。将此细胞悬液准确地进行系列稀释，直至每毫升含10个细胞。将稀释好 的细胞悬液接种于已铺有饲养细胞层的96孔板中，每孔O.lmL，即每孔含一个细胞，置37°C 5%C02培养箱中培养，5d左右在倒置显微镜下观察细胞克隆生长情况。反复克隆3次，确定 阳性单克隆细胞株，最后克隆株编号，置液氮中保存。取出部分阳性克隆株转入24孔板，继 而转入培养瓶中进行扩大培养。将接种的杂交瘤细胞吹打下来，l〇(K)r/min离屯、lOmin，弃上 清，沉淀物用无血清培养液悬浮混匀，并将细胞调至（1~2) X106个/mL。选择