人尿液α1-酸性糖蛋白检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本公开设及医学免疫体外诊断领域，具体设及一种用胶乳增强免疫透射比浊法检 测人尿液中α1-酸性糖蛋白的试剂盒。
【背景技术】
[0002] α1-酸性糖蛋白（al-acid glycoprotein,AAG，早期称之为乳清粘蛋白）分子量近 40kD，含糖量约45%，pl为2.7-3.5，包括等分子的已糖、已糖胺和唾液酸。AAG是主要的急性 时相反应蛋白，在急性炎症时增高，显然与免疫预防功能有关。AAG由肝和某些肿瘤组织合 成。分解代谢首先经过唾液酸的分子降解而后蛋白质部分很快在肝中消失。AAG可W结合利 多卡因和普糞洛尔，在急性屯、肌梗死时AAG作为一种急性时相反应蛋白可W升高，而干扰药 物剂量的有效浓度(如王克夷，1991)。
[0003] AAG是目前较为敏感的急性期反应的炎症标志物，是急性时相反应物之一。其对炎 症、感染反应早于体溫及白细胞数的变化，故广泛用于临床。
[0004] 2型糖尿病肾病是糖尿病的主要并发症之一，也是近年来糖尿病患者死亡的主要 原因之一。如果能在2型糖尿病患者糖尿病肾病发生的早期及时作出诊断并进行干预性治 疗，肾脏的微损病变可W得到好的控制甚至发生逆转。目前，国内外普遍将24h尿白蛋白排 泄率测定作为糖尿病肾病早期诊断的重要指标。但是，最近一系列的研究报道却对尿白蛋 白在预测和诊断糖尿病肾病中的可靠性提出了质疑，认为其特异性和敏感度并不是很理 想。将尿中的AAG作为辅助诊断指标之一，对2型糖尿病患者糖尿病肾病的发生发展有较好 的预测价值(如鞠北华等人，2013年;化ristiansen M.S等人2005;)。健康的人尿中的AAG的 含量为0.29至0.68mg/24h。高于一定的阔值，则肾组织损害不可逆转，且肾功能受损加剧的 几率很大。
[0005] 目前，市场上检测α1-酸性糖蛋白的试剂盒由于灵敏度低，样本仅限于血清，无法 检测人尿液中α1-酸性糖蛋白（例如CN103076456A和CN103529221A中所公开的试剂盒）。针 对人尿中AAG含量较少，本领域所要解决的技术问题是提供一种胶乳增强免疫透射比浊法 检测人尿液中酸性糖蛋白含量的试剂盒，其灵敏度高、重复性好、操作简单、能够进行批量 样本检测。
【发明内容】
[0006] 鉴于上述技术问题，本公开提供一种检测人尿液中α1-酸性糖蛋白的试剂盒，该试 剂盒包含:第一试剂、第二试剂和任选地校准品。
[0007] 在一些实施方式中，所述第一试剂包含缓冲液、电解质、表面活性剂、稳定剂、防腐 剂。在一些实施方式中，所述的第二试剂包含:缓冲液、包被有α1-酸性糖蛋白抗体的胶乳颗 粒、电解质、防腐剂。在一些实施方式中，所述校准品包含:缓冲液、浓度已知的α 1 -酸性糖蛋 白、稳定剂、防腐剂、抗氧化剂。
[000引在一些实施方式中，所述第一试剂、第二试剂和校准品中缓冲液的抑在5.5至9.0 之间；例如5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5;在一些具体的实施方式中，缓冲液的抑在6.0至 7.5之间。在本申请上下文中，表述"在…之阿'包含端点值。
[0009] 在一些实施方式中，所述第一试剂、第二试剂和校准品中缓冲液的浓度在10至 lOOmmol/L 之间；例如，10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100mmol/l;在一些 具体的实施方式中，浓度在10至25mmol/L之间。
[0010] 在一些实施方式中，第一试剂、第二试剂和校准品中缓冲液各自独立地选自： TRIS/肥1缓冲液、PBS缓冲液、甘氨酸缓冲液、己比妥缓冲液及其组合。在一些具体的实施方 式中，缓冲液是TRIS/HC1缓冲液。
[0011] 在一些实施方式中，第一试剂、第二试剂和校准品中缓冲液的种类、浓度或pH值分 别是相同的或者是不同的。
[0012] 在一些具体的实施方式中，第一试剂中缓冲液是TRIS/HC1缓冲液，抑在7.0至7.5 之间，且浓度在15至25mmol/L之间；优选为20mmol/L抑为7.5的TRIS/肥1缓冲液。
[0013] 在一些具体的实施方式中，第二试剂中缓冲液是TRIS/HC1缓冲液，抑在7.0至7.5 之间，且浓度在10至15mmo 1/L之间；优选为1 Ommo 1/L抑为7.5的TRIS/肥1缓冲液。
[0014] 在一些具体的实施方式中，校准品中缓冲液是TRIS/肥1缓冲液，抑在6.0至6.5之 间，且浓度在10至15mmol/L之间；优选为15mmol/L抑为6.0的TRIS/肥1缓冲液。
[0015] 在一些实施方式中，所述第一试剂中电解质的浓度在50至500mmol/L之间，例如 75、100、120、150、200、250、300、350、400、450mmol/L。在一些实施方式中，所述第二试剂中 电解质的浓度在 10至300mmol/L之间，例如 10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、150、 200、250、300111111〇1/1。在一些实施方式中，第一试剂和第二试剂中电解质各自独立地选自： 氯化钢、氯化儀、氯化钟、硫酸儀及其组合。第一试剂和第二试剂中的电解质的种类或浓度 是相同的或者是不同的。在一些具体的实施方式中，电解质是250mmol/L氯化钢。
[0016] 在一些实施方式中，第一试剂、第二试剂和校准品中防腐剂的浓度在O.lg/lOOml 至 Ig/lOOml 之间；例如 0.1、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0g/ 100ml。第一试剂、第二试剂和校准品中防腐剂各自独立地选自：叠氮钢、叠氮裡、山梨酸钟、 亚硝酸钢及其组合。所述第一试剂、第二试剂和校准品中的防腐剂的种类或浓度是相同的 或者是不同的。在一些具体的实施方式中，防腐剂是O.lg/lOOml的叠氮钢。
[0017] 在一些实施方式中，所述第一试剂和校准品中稳定剂的浓度在O.lg/lOOml至3g/ 100ml之间，例如0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0g/100ml。在一些实施方式中，第一试 剂和校准品中稳定剂各自独立地选自：甘露糖、葡萄糖、壳聚糖、山梨醇及其组合。所述第一 试剂和校准品中的稳定剂是相同的或者是不同的。在一些具体的实施方式中，第一试剂和 校准品中稳定剂是0.1 g/lOOml的山梨醇。
[0018] 在一些实施方式中，第一试剂的表面活性剂的浓度在O.lg/lOOml至Ig/lOOml之 间；例如0.1、0.2、0.3、0.5、0.6、0.8、1.0g/100ml。在一些实施方式中，表面活性剂选自：非 离子表面活性剂、阴离子表面活性剂及其组合。非离子表面活性剂选自：Tween、化iton X- 100及其组合。阴离子表面活性剂选自：SDS、脂肪醇聚氧乙締横酸钢、聚茵脑横酸钢及其组 合。在一些具体的实施方式中，表面活性剂是0.1至0.5g/100ml的非离子表面活性剂。在一 些具体的实施方式中，表面活性剂是0.1 g/lOOml的Tween,优选Tween-20或Tween-80。
[0019] 在一些实施方式中，校准品中抗氧化剂的浓度在O.lg/lOOml至5. Og/lOOml之间； 例如 0.1、0.2、0.3、0.5、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5g/100ml。在一些实施 方式中，抗氧化剂选自：没食子酸丙醋、二下基径基苯、叔下基对径基茵香酸及其组合。在一 些具体的实施方式中，抗氧化剂是O.lg/lOOml的二下基径基苯。
[0020] 在一些实施方式中，α1-酸性糖蛋白抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。所述α1-酸 性糖蛋白抗体选自：羊抗人抗体、兔抗人抗体、鼠抗人抗体、鸡抗人抗体和鸭抗人抗体。
[0021] 在一些实施方式中，α1-酸性糖蛋白抗体在第二试剂中的浓度是lOmg/L至50mg/L 之间；例如 10、20、24、25、30、35、40、45、50111邑/1，优选15至25111邑/1。
[0022] 在一些实施方式中，胶乳颗粒的粒径在50nm至250nm之间，优选lOOnm至200nm之 间，更优选100至150nm，例如100、120、130、140、150nm。所述胶乳颗粒是簇基修饰的聚苯乙 締胶乳颗粒。在一些实施方式中，包被有α1-酸性糖蛋白抗体的胶乳颗粒浓度在0.1 g/lOOml 至 5.0g/100ml 之间；例如 0.1、0.2、0.3、0.5、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、 4.5g/100ml。在一些具体的实施方式中，包被有α1-酸性糖蛋白抗体的胶乳颗粒浓度是 0.1 g/lOOml或0.2g/100ml。在一些实施方式中，胶乳颗粒物理吸附至或化学交联至α1-酸性 糖蛋白抗体。
[0023] 在一些实施方式中，所述校准品中α1-酸性糖蛋白的浓度在0.20mg/L至6.00mg/L 之间。可用于本公开试剂盒的校准品是市售校准品或者根据需要的浓度自行配制。技术人 员理解，校准品的用途在于绘制标准曲线，从而使未知浓度的待测样本在标准曲线上得到 对应的读值。通常而言，Ξ个已知浓度即可绘制标准曲线。在一些实施方式中，校准品包含3 至7不同的α1-酸性糖蛋白浓度。在一些实施方式中，校准品包含5不同的α1-酸性糖蛋白浓 度。尽管本申请中采用了特定的浓度，但是技术人员理解α1-酸性糖蛋白的浓度分别为，但 不限于0.0 Omg/L、0.20mg/L、1. OOmg/L、3. OOmg/L、4.50mg/L、6. OOmg/L。
[0024] 在一些具体的实施方式中，本公开设及一种用于检测人尿液中α1-酸性糖蛋白的 胶乳增强免疫透射比浊试剂盒，其包含:试剂R1、试剂R2和5个已知浓度的α1-酸性糖蛋白校 准品，其中：
[00巧]?试剂R1，包含：
[00%]缓冲液 10至 100mm〇l/L，pH 5.5-9.0;
[0027] 电解质 50 至 500mmol/l;
[0028] 表面活性剂0.1 g/lOOml至Ig/lOOml;
[00巧]稳定剂0.1 g/lOOml至3g/100ml;和
[0030] 防腐剂 O.lg/lOO