一种检测金黄色葡萄菌肠毒素a的方法及检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及纳米生物传感以及生物检测领域，具体是一种检测金黄色葡萄菌肠毒 素 A的方法及检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 食品安全已成为影响人类自身健康安全和社会稳定的重要因素，由食源性疾病和 食品污染引发的食物中毒与食源性疾病平均每年发生数十亿例，发达国家每年至少有三分 之一的人群患食源性疾病。其中由微生物污染造成的食源性疾病位居首位，而金黄色葡萄 球菌肠毒素又是引起细菌性食物中毒的最主要的食源性疾病。金黄色葡萄球菌肠毒素由金 黄色葡萄球菌产生，其污染源和传播途径极广，可途径食品加工人员、炊事员或销售人员带 菌，造成食品污染;食品在加工前本身带菌，或在加工过程中受到了污染，产生了肠毒素，弓丨 起食物中毒;熟食制品包装不严，运输过程受到污染;奶牛患化脓性乳腺炎或禽畜局部化脓 时，对肉体其他部位的污染。因此，防止其污染非常困难。金葡菌可产生六3、(：、0』、？等多种 肠毒素。金葡菌性食物中毒以A型肠毒素引起者最多。因此，对金黄色葡萄菌肠毒素 A监测非 常必要。
[0003] 目前，金黄色葡萄菌肠毒素 A的主要检测方法有:色谱法、免疫层析法、色谱-质谱 联用法等方法。最近，Zhouping Wang公开了一种基于稀土荧光纳米晶-肠毒素 A核酸适体的 金黄色葡萄菌肠毒素的检测方法。
[0004] 但色谱-质谱联用法仪器价格昂贵，并且需要专门技术人员才能进行检测工作，技 术要求高，难于普及;免疫法试剂贵、且所用生物试剂非常容易失活，或需使用价格较昂贵 的通过标记的DNA等不足。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种检测金黄色葡萄菌肠毒素 A的方法及试剂盒。
[0006] 本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
[0007] 1. -种检测金黄色葡萄菌肠毒素 A的方法，该方法包括如下步骤：
[0008] 1)将各DNA储备液在95 °C下经加热处理5分钟，使用前，并在室温下放置30分钟，然 后，分别取含3. Ομπιο?金黄色葡萄菌肠毒素 A核酸适体Apt的杂交缓冲溶液40yL和3. Ομπιο?信 号探针ssDNA的杂交缓冲溶液40yL置于2ml离心管中，在37°C下杂交1小时，生成金黄色葡萄 菌肠毒素 A核酸适体-信号探针杂交物Apt-ssDNA。
[0009] 2)在37°C下，分别将浓度为0~50ng/mL的金黄色葡萄菌肠毒素 A添加到Apt-ssDNA 溶液中，金黄色葡萄菌肠毒素 A与金黄色葡萄菌肠毒素 A核酸适体反应，生成核酸适体-金黄 色葡萄菌肠毒素 A，释放出ssDNA。这时，体系中有ssDNA、剩余未反应的APT-ssDNA和核酸适 体-金黄色葡萄菌肠毒素 A等物质；所述金黄色葡萄菌肠毒素 A核酸适体为5 ' -AGCAGCACAG AGGTCAGATGTACTTATGCA TTTCCTCCCA CGATCTTATT TGAGAGTGAC CCTATGCGTG CTACC-3'。 [0010] 3)加入 10yL缓冲溶液，缓冲溶液组成为50mM Tris-HCl，10mM MgCl2，l〇mM(NH4) 2S〇4，pH 7.5,然后加入dNTP(10mM)18yL。再向体系中加入2yL· Phi29DNA聚合酶lOu/μΙ，在37 °C下反应15分钟，使得以金黄色葡萄菌肠毒素 A核酸适体-信号探针杂交序列Ap-ssDN为摸 板扩增成双链DNA。在65 °C下保持10分钟使Phi 29DNA去活。
[0011] 4)再向该反应体系中加入2yL Exo III核酸外切酶20u/yL，在37°C下反应30分钟， Exo III核酸外切酶使选择性地催化双链DNA水解成单核苷酸，单链探针ssDNA不水解而保 留下来;所述的单链信号探针ssDNA为5 ' -CCCCCCACACCCGATCCCCCCGGTAGCACGCATAGG-3 '。 [0012] 5)向反应液中加入25yL lmmol硝酸银和10mM，pH7.0的180yL PBS，然后，混合物在 室温下避光或暗室中放置10分钟后，在快速搅拌下，加入l〇〇yL浓度为ImM的新制备的抗坏 血酸溶液，然后在45 °C下反应5~lOmin;
[0013] 6)将溶液转移至微量比色皿，以波长为585nm的光为激发光，测定体系荧光发射 (610-800nm)光谱，体系的荧光发射峰的强度与金黄色葡萄菌肠毒素 A存在线性关系，其线 性方程式为，y = 286.87+96.12C，相关系数r = 0.9988,线性范围0.002~0.20ng/mL，检测限 lpg/mL，回收率在97.5~114.3%。其它细菌毒素等生物小分子对金黄色葡萄菌肠毒素 A的 检测无干扰。
[0014] 上述金黄色葡萄菌肠毒素 A核酸适体为5'-AGCAGCACAG AGGTCAGATGTACTTATGCA TTTCCTCCCA CGATCTTATT TGAGAGTGAC CCTATGCGTG CTACC-3'。
[0015] 上述的单链信号探针ssDNA为5 ' -CCCCCCACACCCGATCCCCCCGGTAGCACGCATAGG-3 '。
[0016] 2. -种检测金黄色葡萄菌肠毒素 A的试剂盒，包括:金黄色葡萄菌肠毒素 A核酸适 体、单链信号探针ssDNA、DNA扩增体系、核酸外切酶、银离子还原检测体系，所述金黄色葡萄 菌肠毒素 A核酸适体为5'-AGCAGCACAGAGGTCAGATG TACTTATGCA TTTCCTCCCA CGATCTTATT TGAGAGTGAC CCTATGCGTGCTACC-3' ；所述的单链信号探针DNA为5'-CCCCCCACACCCGATCCCCCCGGTAGCACGC ATAGG-3 ' ；所述DNA扩增体系包括缓冲溶液(1^8_ HCl、MgCl2、（NH4)2S〇4)、三磷酸脱氧单核苷酸混合物dNTP和Phi29DNA聚合酶;所述核酸外切 酶为Exo III核酸外切酶;所述的银离子还原检测体系中还原剂为抗坏血酸。
[0017] 3. -种可用于检测金黄色葡萄菌肠毒素 A的金黄色葡萄菌肠毒素 A核酸适体，其碱 基序列为5'-AGCAGCACAG AGGTCAGATG TACTTATGCA TTTCCTCCCACGATCTTATT TGAGAGTGAC CCTATGCGTG CTACC-3'。
[0018] 本发明的检测原理如下：先让Apt与ssDNA杂交；当有金黄色葡萄菌肠毒素 A存在 时，杂交链与金黄色葡萄菌肠毒素 A反应释放出ssDNA;体系中存在Apt-ssDNA(剩余的）， Apt-金黄色葡萄菌肠毒素 A和ssDNAjpt-金黄色葡萄菌肠毒素 A不能诱导银离子还原成近 红外荧光银纳米簇，Apt-金黄色葡萄菌肠毒素 A存在对测定无干扰;杂交链可能有干扰;为 了消除杂交链的干扰:a.利用DNA扩增，使杂交链成双链DNA，b.用核酸外切酶选择性地催化 双链DNA水解成单核苷酸，而单链信号探针ssDNA不水解而保留下来。此时体系中只留下可 诱导生成近红外荧光银纳米簇的ssDNA，通过检测体系的荧光强度，依据荧光强度与金黄色 葡萄菌肠毒素 A的量的关系，可以测定金黄色葡萄菌肠毒素 A的含量。由于消除体系中背景 荧光的干扰，提高了检测的灵敏度和精度。
[0019] 本发明的优点：
[0020] 本发明的检测方法和试剂盒，消除了背景荧光的干扰，提高了金黄色葡萄菌肠毒 素 A的检测灵敏度和精度。
【具体实施方式】
[0021] 下面结合实施例对本发明作进一步说明。
[0022] 实施例1
[0023] 检测金黄色葡萄菌肠毒素 A的试剂盒包括:金黄色葡萄菌肠毒素 A核酸适体、单链 信号探针ssDNA、DNA扩增体系、核酸外切酶、银离子还原检测体系。
[0024] 所述金黄色葡萄菌肠毒素 A核酸适体为5'-AGCAGCACAG AGGTCAGATGTACTTATGCA TTTCC