一种瓜类蔬菜中544种农药残留lc-q-tof/ms侦测技术的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及食品卫生、农产品安全检测领域，特别涉及一种用于瓜类蔬菜中544种 农药残留的侦测方法。
【背景技术】
[0002] 早在1976年世界卫生组织(WH0)、粮农组织(FA0)和联合国环境规划署(UNEP)共同 建立了全球环境检测系统/食品项目（Global Environment Monitoring System，GEMS/ Food)，旨在掌握会员国食品污染状况，了解食品污染物摄入量，保护人体健康，促进贸易发 展。现在，世界各国都把食品安全提升到国家安全的战略地位。农药残留限量是食品安全标 准之一，也是国际贸易准入门槛。同时，对农药残留的要求呈现出品种越来越多，限量越来 越严格的发展趋势，也就是国际贸易设立的农药残留限量门槛越来越高。现在欧盟已制定 了839种农药的162248项MRL标准，美国制定了351种农药的39147项MRL标准，日本制定了 579种农药的51600多项MRL标准，我国2014年发布了381种农药的3650项MRL标准。目前，国 际上普遍采用的一律标准限量为l〇yg/kg。因此，食品安全和国际贸易都呼唤高通量快速农 药残留检测技术，这无疑也给广大农药残留分析工作者提供了机遇和挑战。在目前的众多 农药残留分析技术中，色谱质谱联用技术是实现高通量多残留快速检测的最佳分析手段。
[0003] 目前农药残留分析多以气相色谱、液相色谱、气相色谱-质谱和液相色谱-质谱联 用技术为主。这些检测技术都首先需要农药标准品对照进行定性。例如，对100种农药的检 测就需要准备相应的100种农药标准品对照，而这100种之外的农药都会被漏检。在农兽药 残留实验室的实际工作中，绝大多数实验室都不会储备数百种农药标准品，其原因是农药 标准品不仅价格昂贵，而且有效期只有2、3年，需要重复投资。一般实验室常备农药标准品 只有几十种，其日常监测的农药品种也就只限于这几十种，由此造成食品安全监测漏洞。
[0004] 本发明人团队经过多年潜心研究，研发了二种544种农药的精确质量数据库以及 一种瓜类蔬菜中544种农药的残留侦测技术，实现了不需标准品对照、即可对瓜类蔬菜中 500种以上农药残留，同时快速侦测检测，满足了当前农产品中农药残留高通量快速检测的 急需。
【发明内容】
[0005] 本发明在评价了世界常用1000多种农药的质谱行为特征的基础上，创新性地建立 了 544种农药T0F/MS和Q-T0F/MS精确质量数据库;创新性地建立了以高分辨精确质量数、同 位素分布及同位素丰度等化合物质谱信息为识别标准的，依据T0F/MS和Q-T0F/MS精确质量 数据库对544种农药进行侦测和确证的LC-Q-T0F/MS技术方法;创新性地开发了与之配套的 瓜类蔬菜中农药残留高通量样品制备技术。实现了只需要一次样品制备、一次进样检测，就 可以对瓜类蔬菜中500多种农药的快速侦测，并且可对侦测出的农药进行Q-T0F/MS数据库 确证，彻底改变了原有以化合物标准物为参比的定性模式，是一种不需要标准物对照，快 速、高通量、准确可靠的农药残留检测新技术。
[0006] -、本发明创新性在于：
[0007] 1、创新性地建立了544种农药精确质量可达到O.OOOlm/z的精确质量数据库，包括 T0F/MS数据库和Q-T0F/MS数据库。
[0008] 2、T0F/MS数据库包含544种农药的英文名称、化学分子式、保留时间、精确质量数、 同位素分布、同位素丰度以及母离子和碎片离子的全扫描质谱图信息，信息量大，准确全 面。
[0009] 3、Q-T0F/MS数据库中每种农药碎片离子的全扫描质谱图信息，是通过对八个不同 碰撞能量下全扫描质谱图优选，得到的离子信息丰富的四个不同碰撞能量下碎片离子全扫 描图。
[0010] 4、创新性地建立了以高分辨精确质量数、同位素分布及同位素丰度等化合物质谱 信息为识别标准的，依据T0F/MS和Q-T0F/MS精确质量数据库对544种农药进行侦测和确证 的LC-Q-T0F/MS技术方法，彻底改变了原有以化合物标准物为参比的定性模式，是一种不需 要标准物对照，快速、高通量、准确可靠的农药残留检测新技术。
[0011] 5、本发明建立的残留侦测技术方法能够依据目标化合物的保留时间、精确质量 数、同位素分布以及同位素丰度等信息，通过与T0F/MS数据库中化合物的对应信息检索比 对，给出目标化合物的匹配度得分值。依据目标化合物的得分值，实现对农药的定性侦测。
[0012] 6、本发明建立的残留侦测技术方法能够依据目标化合物碎片离子的全扫描质谱 图信息，通过与Q-T0F/MS数据库中化合物碎片离子的全扫描质谱图信息检索比对，给出目 标化合物的匹配度得分值，实现对目标化合物的定性确证。相比传统的检测定性确证方法， 由于采用了全扫描质谱图信息比对，具有更高的定性准确度。
[0013] 7、开发了与残留侦测技术方法配套的农产品中农药残留高通量样品制备技术。实 现了只需要一次样品制备、两次进样检测，就可以对农产品中500多种农药的快速侦测和确 证。
[0014] 8、LC-Q-T0F/MS主要侦测技术指标：扫描范围50-1600m/z;测定的精确质量可达 0.0 OOlm/z;质量精度可控制在分子质量的lOppm以内；扫描速度在50-1600m/z范围为每秒4 次。LC-Q-T0F/MS主要侦测技术特点：样品一次制备，可在1小时内完成544种农药侦测、定性 与确证;80%以上农药确证点达到10个以上;在同时侦测的544种农药中，327种农药侦测灵 敏度低于一律标准10微克/千克，占比64.1%，基本满足各国农药残留MRL水平筛查的要求。 [00 15]二、本发明采用的技术方案：
[0016] 1、建立精确质量数据库
[0017] 1.1 T0F/MS数据库的建立
[0018] 在T0F/MS模式下，分别测定每种农药标准物在指定色谱质谱条件下的保留时间， 确定该化合物ESI源下的离子化形式(+H，+NH 4，+Na)及化学式，得到每种化合物母离子的精 确质量数，同位素峰分布和丰度比。将544种农药的名称、保留时间、分子式、精确质量数、同 位素峰分布和丰度比等信息导入到数据库CSV软件文件中，形成T0F/MS数据库。
[0019] 1.2 Q-T0F/MS数据库的建立
[0020] 在Agilent MassHunter数据采集界面依次输入T0F/MS数据库中544种农药的母离 子，在Q-T0F/MS模式下，对544种农药分别在8个碰撞能量下，进行碎片离子全扫描质谱图采 集。优选其中离子信息丰富的3-5个不同碰撞能量下碎片离子全扫描质谱图导入数据库软 件文件中，并与对应的农药信息相关联，建成Q-TOF/MS数据库。
[0021] 2、建立以高分辨精确质量数、同位素分布及同位素丰度等化合物信息为识别标准 的，544种农药LC-Q-T0F/MS侦测和确证技术方法，技术步骤包括：
[0022] 2.1样品制备：瓜类蔬菜样品经1%醋酸乙腈提取，Carbon/NH2柱净化，乙腈+甲苯 (3+1，v/v)洗脱残留农药，经浓缩、溶解和过滤后制成待测样液；
[0023] 所述瓜类蔬菜包括黄瓜、西萌芦、棚瓜、冬瓜、瓠瓜、南瓜、丝瓜、佛手瓜、笋瓜和生 瓜；
[0024] 2.2色谱质谱检测：采用配有反相色谱柱（ZORBAX SB-C18 column of 2.1mmX 100mm，3.5μπι)的液相色谱分离待测样液中的农药，配有电喷雾离子源的LC-Q-T0F-MS检测； [0025] 2.3 T0F/MS数据库定性侦测方法:在Agilent MassHunter定性软件中调用已建立 的T0F/MS数据库，依据T0F/MS数据库对目标化合物定性检索，检索参数保留时间偏差限定 为± 0.5min，精确质量偏差限定为± lOppm，离子化形式选择+H，+NH4，+Na模式，软件会依据 每种化合物保留时间、精确质量等要素的实测值与T0F/MS数据库中理论值的偏差，以及同 位素分布和同位素比例四个参数，通过科学地设定各个要素在匹配度得分计算中的权重 (其中精确质量数偏差的权重最高），给出检索匹配得分值，检索匹配得分值较高的化合物， 为疑似检出化合物，依据T0F/MS数据库定性侦测农产品中农药残留的方法准确度，达到 90%以上；
[0026] 2.4 Q-T0F/MS数据库定性确证方法：在Targeted MS/MS采集模式下，输入疑似检 出化合物的母离子，保留时间和最佳的碰撞能量，对待测样液再次检测，将检测质谱图与Q-T0F/MS数据库中化合物碎片离子的全扫描质谱图，在镜像对比条件下匹配，根据特征离子 分布与谱库是否一致，二级碎片精确质量数偏差和碎片离子的比例给出得分，其匹配得分 值较高，即确认检出该目标化合物。该确证方法采用全扫描质谱图匹配确证，使80%以上农 药确证点可以达到10个以上，比标准的4个确证点要求，具有更高的定性准确度。
[0027]三、本发明的技术内容：
[0028]本发明提供二种544种农药的精确质量数据库以及一种用于检测瓜类蔬菜中544 种农药残留侦测技术。
[0029] 1、本发明提供的二种精确质量数据库为T0F/MS数据库和Q-T0F/MS数据库。
[0030] 1.1 T0F/MS数据库技术内容包括:544种农药的化