一种口蹄疫病毒非结构蛋白3abc抗体的阻断elisa试剂盒及检测方法

文档序号:9909338阅读:752来源:国知局
一种口蹄疫病毒非结构蛋白3abc抗体的阻断elisa试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001 ]本发明属于生物技术领域,更具体涉及一种口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体的阻 断ELISA试剂盒,同时还涉及一种口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体的阻断ELISA试剂盒的检 测方法。
【背景技术】
[0002] 口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)感染引起的偶蹄动物共患的一种急性、热性、高度接触性的传染病, 感染后发病率1〇〇%。临床特征是在口腔黏膜、蹄部和乳房皮肤发生水疱性疹。该病传播途 径多、速度快,曾多次在世界范围内暴发流行,造成巨大政治、经济损失。鉴于此,世界动物 卫生组织(0ΙΕ)将其列为A类传染病之首。目前,有三分之二的0ΙΕ成员国流行FMD,时刻威胁 着无 FMD国家和地区的家畜安全和畜产品贸易。
[0003] 区分FMD野毒感染动物和疫苗免疫动物能准确反映一个地区的FMD感染状态,也是 0ΙΕ判断一个国家或者地区有无 FMD的依据。目前畜牧业生产中使用的口蹄疫疫苗主要是灭 活疫苗,疫苗在制备过程中,病毒经过灭活,纯化和乳化等过程,非结构蛋白受到严重破坏, 疫苗中几乎不存在非结构蛋白,因此,免疫动物体内无非结构蛋白抗体。感染口蹄疫野毒的 动物,病毒经过生物合成和组装过程中产生非结构蛋白,因此野毒感染动物体内存在非结 构蛋白抗体。所以,检测非结构蛋白抗体可以区分免疫动物和感染动物。经过各国学者多年 的研究,已证明检测非结构蛋白3ABC是确定动物是否感染口蹄疫的最佳方法。
[0004] 在口蹄疫抗体的诊断过程中,ELISA与其他免疫学检测技术相比具有灵敏、特异、 快速且易于实现自动化操作等优点,检测抗体的ELISA方法一般分为间接ELISA和阻断 ELISA或者竞争ELISA,间接ELISA方法容易出现非特异性反应,而阻断ELISA或者竞争ELISA 采用了单克隆抗体和阻断技术,方法更为敏感和特异;本专利所采用的方法即为阻断ELISA 方法,使试剂盒具有很好的敏感性和特异性。

【发明内容】

[0005] 本发明的目的是在于提供了一种口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体的阻断ELISA试 剂盒,该试剂盒的优点在于使用了合成肽为包被抗原和辣根过氧化物酶标记的单克隆抗 体,减少了非特异性反应,提高了检测的灵敏性和特异性。
[0006] 本发明的另一个目的是在于提供了一种口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体的阻断 ELISA试剂盒的检测方法,该方法敏感性强、特异性好与其荷兰Ceditest试剂盒的总符合率 为91.06%,有着很好的应用前景。
[0007] 为了实现上述的目的,本发明采用以下技术措施:
[0008] 一种口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体的阻断ELISA试剂盒,包括酶标板、样品稀释 液、辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体、阳性对照、阴性对照、显色液A、显色液B、终止液、洗 涤液。
[0009] 所述的酶标板是以GPYTGPLERQKPLKC作为合成肽的序列与载体蛋白OVA进行偶联 的多肽作为包被抗原,以〇. lmol/LpH9.6的碳酸氢钠溶液作为包被缓冲液;
[0010] 所述的样品稀释液:含〇 · 5% (M/V)BSA的PBS缓冲溶液;
[0011] 所述的辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体,以合成肽作为免疫原制备的单克隆抗 体;
[0012] 所述的阳性对照血清为合成肽抗原免疫的兔高免血清;
[0013] 所述的阴性对照为未感染口蹄病毒的健康猪牛羊血清;
[0014]所述的显色液A为含有50mg/mL的过氧化氢脲的梓檬酸盐缓冲溶液;
[0015] 所述的显色液B为含有0.2mg/mL TMB,pH5.0的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲溶液;
[0016] 所述的终止液为含0.25 %体积比氢氟酸溶液;
[0017] 所述的洗涤液为含有〇 · 〇5 % (V/V)TWeen-20的PBS缓冲液;
[0018]所述的单克隆抗体,其制备过程是采用杂交瘤细胞技术,以GPYTGPLERQKPLKC作为 合成肽序列与载体蛋白KLH进行偶联,偶联后的合成肽作为免疫原,免疫BALB/c小鼠,取免 疫鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合,通过HAT培养基筛选,经过阻断ELISA筛选出来的阳性 单克隆抗体,命名为杂交瘤细胞株4G6,保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心,保藏号 CCTCC N0:C201639。
[0019] 一种口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体的阻断ELISA试剂盒的检测方法,其步骤是: [0020] 1)将待检血清按1:2比例稀释于血清稀释板中,吸取稀释好的样品液加入包被好 抗原的酶标板中,每孔加入100yL,37°C反应lh;
[0021 ] 2)次日,用洗涤液洗板5次,最后一次拍干;
[0022] 3)加入100yL酶标抗体,37 °C作用lh;
[0023] 4)取出酶标板,甩掉孔中溶液,用洗涤液洗板5次,最后一次拍干;
[0024] 5)加入显色液A50yL、显色液B50yL,混匀后室温(20~25°C)避光显色lOmin,每孔 加入终止液50yL,15min内用酶标仪测定每孔的0D 63Qr?读值。
[0025] 6)阻断率计算:阻断率(PI) = 1-S(样品0D63Qr?)/N(阴性对照0D63Q·);
[0026] 7)试验成立条件:阴性对照0D63Qr?大于0.500,阳性对照的阻断率大于60%;
[0027] 8)判定标准:猪、牛、羊血清阻断率大于等于0.4判为非结构蛋白3ABC抗体阳性,血 清阻断率小于0.4判为非结构蛋白3ABC抗体阴性。
[0028]本发明的阻断ELISA方法与现有技术相比,具有如下显著优点:
[0029] 一是采用间接法包被抗原,抗原为合成和偶联的多肽,抗原纯度高,特异性好,肽 段一端偶联载体蛋白,使与抗体结合端暴露出来,更好的展示抗原结构,提高与目的抗体的 结合率;二是利用单克隆抗体具有高均质性和高特异性的特点,以特异性单克隆抗体作为 检测抗体,使得该方法更加特异与敏感,而且可以同时检测猪、牛、羊等多种易感动物的血 清,不同于间接ELISA方法,每种动物血清都要配备相应的酶标抗体;三是阳性对照采用合 成的多肽免疫制备的兔多抗,以兔多抗作为阳性对照,免去了同时制备猪、牛、羊的抗血清, 兔多抗做为阳性对照在间接ELISA中不能使用,因此,本专利的阻断ELISA方法具有优越性。
【具体实施方式】
[0030] 以下结合具体实施例,对本发明进行详细说明。
[0031] 实施例1:
[0032] 一种口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC抗体的阻断ELISA试剂盒,包括酶标板、样品稀释 液、辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体、阳性对照、阴性对照、显色液A、显色液B、终止液、洗 涤液。
[0033]所述的酶标板是以GPYTGPLERQKPLKC作为合成肽的序列与载体蛋白0VA进行偶联 的多肽作为包被抗原,以〇. lmol/LpH9.6的碳酸氢钠溶液作为包被缓冲液;
[0034] 所述的样品稀释液:含0.5% (M/V)BSA的PBS缓冲溶液;
[0035] 所述的辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体,以合成肽作为免疫原制备的单克隆抗 体;
[0036] 所述的阳性对照血清为合成肽抗原免疫的兔高免血清;
[0037] 所述的阴性对照为未感染口蹄病毒的健康猪牛羊血清;
[0038] 所述的显色液A为含有50mg/mL的过氧化氢脲的梓檬酸盐缓冲溶液;
[0039]所述的显色液B为含有0.2mg/mL TMB,pH5.0的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲溶液;
[0040]所述的终止液为含0.25 %体积比氢氟酸溶液;
[00411 所述的洗涤液为含有0.05% (V/V)TWeen-20的PBS缓冲液;
[0042] -种多肽抗原的筛选和酶标板的制备,其步骤是:
[0043] 1、有效肽段的选择和确定,
[0044] 通过DNAStar、Genebank等分析软件对口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC的抗原表位进 行预测,确定天然抗原的氨基酸序列,然后寻找该肽段所针对的抗原决定簇(epitopes),将 不同序列对比,合成优化的肽段。分别将多肽与载体蛋白0VA偶联作为包被抗原,制备抗原 酶标板;然后分别将多肽与载体蛋白KLH偶联作为免疫抗原,免疫6周龄BALB/c小鼠,三次免 疫后采血测效价,使用间接ELISA检测不同多肽免疫后血清抗体的效价,本发明从以下肽段 进行对比筛选:
[0045] 1:GPYTGPLERQKPLKC
[0046] 2:GPYAGPMERQKPLKC
[0047] 3:GPYEGPVKKPVALKC
[0048]多肽序列1 (GPYTGPLERQKPLKC)与载体蛋白0VA偶联,制备抗原包被板,分别与多肽 序列1 (GPYTGPLERQKPLKC)、2(GPYAGPMERQKPLKC)、3(GPYEGPVKKPVALKC)免疫后的血清反应, 结果如表1-1:
[0049]表1-1免疫后血清效价的测定
[0050]
[0051]
[0052] 多肽序列2 (GPYAGPMERQKPLKC)与载体蛋白OVA偶联,制备抗原包被板,分别与多肽 序列 1 (GPYTGPLERQKPLKC)、2(GPYAGPMERQKPLKC)、3(GPYEGPVKKPVALKC)免疫后的血清反应, 结果如表1-2:
[0053]表1-2免疫后血清效价的测定
[0054]
[0
当前第1页1 2 3 
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1