-乙酰基-磺胺甲噁唑残留标准物质的制备方法

文档序号:9920978阅读:794来源:国知局
-乙酰基-磺胺甲噁唑残留标准物质的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于水产品安全检测技术领域,更具体涉及一种黄颡鱼组织中磺胺甲噁唑 代谢产物N4-乙酰基-磺胺甲噁唑残留标准物质的制备方法,适用于黄颡鱼肌肉、肝脏、肾 脏、鳃和卵巢组织中磺胺甲噁唑代谢产物N 4-乙酰基-磺胺甲噁唑残留标准物质的制备。
【背景技术】
[0002] 磺胺甲噁唑(Sulfamethoxazole,SMZ),属于广谱抗菌药物,是全球范围内销售量 和使用量最大的药物之一,广泛用于畜禽及水产养殖业疾病的防治。人体长期摄入含有磺 胺类药物残留的动物性食品容易导致药物在体内蓄积,易导致细菌耐药性的产生,对人类 的身体健康产生很大的危害。近年来,磺胺甲噁唑在体内主要被N-乙酰基转移酶代谢为N 4-乙酰磺胺甲噁唑,而且磺胺甲噁唑的毒性与体内的代谢产物有关。摄入含磺胺类药物残留 的食物后会在人体内蓄积,当药物蓄积到一定浓度时会对人体机能产生损害,可产生过敏、 尿结晶、造血紊乱和致癌等毒性反应,因此,磺胺类药物在动物源性食品中的残留越来越受 到重视。
[0003] 为保障水产品质量安全,进而保护人类的健康,提供一种可靠的定性、定量方法分 析水产品中磺胺甲噁唑的代谢产物N4-乙酰基-磺胺甲噁唑是非常必要的,但目前的分析方 法主要采用在水产品中添加的方式来判断水产品中N 4-乙酰基-磺胺甲噁唑分析方法的准 确度、精密度以及对其进行定量。但通过直接添加N4-乙酰基-磺胺甲噁唑的方式与磺胺甲 噁唑在水产动物体内代谢产生N 4-乙酰基-磺胺甲噁唑的方式不同,磺胺甲噁唑在水产动物 体内代谢过程复杂,与水产动物体结合形式多样,在提取方式、提取剂的使用、检测结果的 准确性等均同人为添加药物残留的检测不同,因此,有必要制备一种水产动物组织中磺胺 甲噁唑的代谢产物N 4-乙酰基-磺胺甲噁唑残留标准物质用于分析水产品中磺胺甲噁唑代 谢产物N4-乙酰基-磺胺甲噁唑的残留量,本发明发明了一种黄颡鱼肌肉、肝脏、肾脏、鳃和 卵巢组织中磺胺甲噁唑代谢产物N 4-乙酰基-磺胺甲噁唑残留标准物质的制备方法。
[0004] 目前,国内外未见有黄颡鱼组织中磺胺甲噁唑代谢产物N4-乙酰基-磺胺甲噁唑残 留标准物质的制备方法的报道或申请专利。

【发明内容】

[0005] 本发明的目的是在于提供了一种黄颡鱼肌肉、肝脏、肾脏、鳃和卵巢组织中磺胺甲 噁唑代谢产物N4-乙酰基-磺胺甲噁唑残留标准物质的制备方法,制备的N 4-乙酰基-磺胺甲 噁唑残留标准物质是采用给黄颡鱼口灌磺胺甲噁唑,进入黄颡鱼体内的磺胺甲噁唑被黄颡 鱼代谢为N 4-乙酰基-磺胺甲噁唑,从而在黄颡鱼肌肉、肝脏、肾脏、鳃和卵巢组织中形成一 定浓度的N4-乙酰基-磺胺甲噁唑残留,在给药后合适的时间(黄颡鱼的组织中只有N 4-乙酰 基-磺胺甲噁唑残留,没有磺胺甲噁唑残留)取黄颡鱼的肌肉、肝脏、肾脏、鳃和卵巢组织,制 备出黄颡鱼肌肉、肝脏、肾脏、鳃和卵巢组织中N 4-乙酰基-磺胺甲噁唑残留标准物质,方法 易行,操作简便,并对黄颡鱼肌肉、肝脏、肾脏、鳃和卵巢组织中N4-乙酰基-磺胺甲噁唑残留 标准物质的浓度进行定值,并进行均匀性和稳定性检验。为了实现上述的目的,本发明采用 以下技术措施:
[0006] 其技术构思是:选取60g~90g的已确认不含磺胺甲噁唑及其代谢产物N4-乙酰基-磺胺甲噁唑的雌性黄颡鱼在lm 3水族箱内暂养一周,淡水养殖条件,水温为25 °C~26°C,pH 为7.9~8.1,连续充气,溶解氧值2 5. Omg/L。将0.84g磺胺甲噁唑溶解在5mL的二甲基甲酰 胺中,再用水稀释定容至1 OOmL,配制成8.4mg/mL的磺胺甲噁唑溶液,按60mg/kg黄颡鱼的体 重的剂量口灌磺胺甲噁唑溶液,将口灌磺胺甲噁唑后的黄颡鱼暂放在40L的水族箱中(有 20L水)观察有无回吐,选择没有回吐的黄颡鱼用于制备N 4-乙酰基-磺胺甲噁唑残留标准物 质,将其放到lm3水族箱中,水族箱中有300L水,采集口灌磺胺甲噁唑后216h的黄颡鱼的肌 肉、肝脏、肾脏、鳃和卵巢等组织。采集黄颡鱼的背部肌肉,去皮后切成小块,用高速匀质机 (IKA ULTRA-TURRAX T18 basic)将黄颡鱼的肌肉匀质,制备出肌肉中N4-乙酰基-磺胺甲噁 唑残留标准物质,-20°C冷冻保存,有效期为3个月。打开黄颡鱼的鳃盖,采集黄颡鱼的鳃弓 和鳃丝于10mL离心管中,用小剪刀将其剪碎后,用高速匀浆机(S-10手持式高速匀浆机)将 其匀质,-20°C冷冻保存,有效期为3个月;采集黄颡鱼的卵巢组织于50mL离心管中用高速匀 质机(IKA ULTRA-TURRAX T18basic)将黄颡鱼的卵巢匀浆,制备出卵巢中N4-乙酰基-磺胺 甲噁唑残留标准物质,-20°C冷冻保存,有效期为3个月;采集黄颡鱼的肝脏、肾脏组织分别 放于小塑料封口袋中,用手在袋外将袋内肝脏和肾脏组织碾碎,分别制备出肝脏和肾脏中 N 4-乙酰基-磺胺甲噁唑残留标准物质,-20°C冷冻保存,有效期为3个月。
[0007] 一种黄颡鱼组织中N4-乙酰基-磺胺甲噁唑残留标准物质的制备方法,其步骤是:
[0008] A、选取60g~90g已确认不含磺胺甲噁唑和N4-乙酰基-磺胺甲噁唑的雌性黄颡鱼, 在lm 3水族箱内暂养一周,用于制备黄颡鱼肌肉、肝脏、肾脏、鲍和卵巢组织中N4-乙酰基-磺 胺甲噁唑残留标准物质。淡水养殖条件,水温为25°C~26°C,pH为7.9~8.1,连续充气,溶解 氧值 2 5.0mg/L;
[0009] B、称取0.84g磺胺甲噁唑溶解在5mL的二甲基甲酰胺中,再用水稀释定容至100mL, 配制成8.4mg/mL的磺胺甲噁唑溶液;
[0010] C、按60mg/kg黄颡鱼的体重的剂量口灌磺胺甲噁唑溶液,将口灌磺胺甲噁唑后的 黄颡鱼暂放在40L的水族箱中(有20L水)观察有无回吐,选择没有回吐的黄颡鱼用于制备 N4-乙酰基-磺胺甲噁唑残留标准物质;
[0011] D、将没有回吐的黄颡鱼放入另一水族箱中(有300L水的lm3水族箱中),养殖过程 中不饲喂任何饲料;
[0012] E、从水族箱中取5尾养殖192h-240h后的黄颡鱼,分别采集新鲜黄颡鱼的背部肌 肉、肝脏、肾脏、鲍和卵巢等组织,将相同组织合并。
[0013] F、将采集新鲜黄颡鱼的背部肌肉,去皮后切成小块,用高速匀质机(11^1]1^1^-TURRAX T18 basic)将黄颡鱼的肌肉匀质,制备出肌肉中N4-乙酰基-磺胺甲噁唑残留标准 物质,-20 °C冷冻保存,有效期为3个月。
[0014] G、打开黄颡鱼的鳃盖,用采集新鲜黄颡鱼的鳃弓和鳃丝于1 OmL离心管中,用小剪 刀将其剪碎后,用高速匀浆机(S-?ο手持式高速匀浆机)将其匀质,-20°c冷冻保存,有效期 为3个月;
[0015] H、采集新鲜黄颡鱼的卵巢组织于50mL离心管中用高速匀质机(IKA ULTRA-TURRAX T18 basic)将黄颡鱼的卵巢匀浆,制备出卵巢中N4-乙酰基-磺胺甲噁唑残留标准物质,-20 "€冷冻保存,有效期为3个月;
[0016] I、采集新鲜黄颡鱼的肝脏、肾脏组织分别放于小塑料封口袋中,用手在袋外将袋 内肝脏和肾脏组织碾碎,分别制备出肝脏和肾脏中N 4-乙酰基-磺胺甲噁唑残留标准物质,-20 °C冷冻保存,有效期为3个月;
[0017] 黄颡鱼各组织中N4-乙酰基-磺胺甲噁唑定量分析方法:
[0018] J、将黄颡鱼肝脏、肾脏、鳃、卵巢和肌肉组织的样品进行处理:从采集新鲜黄颡鱼 的肝脏、肾脏、鳃、卵巢和肌肉组织中,分别称取lg肝脏、肾脏、鳃、卵巢和2g肌肉组织样品, 分别放到10mL离心管中,加入50yL lyg/mL的磺胺甲噁唑同位素内标(磺胺甲噁唑-d4),再 加入5mL乙腈,振荡30s左右,超声3min,再加入lg无水硫酸钠,振荡30s左右,8000r/min离心 4 -6min,转移上层液体到10mL离心管中,再向残渣中加入4mL乙腈,振荡30s左右,8000r/ min离心4一6min,合并两次乙腈提取液于同一 10mL离心管中,置49一51°C氮吹仪上氮吹至 干,加入lmL定容溶液溶解残渣,振荡30s左右,加入试剂A,振荡30s左右,8000r/min,离心 4 一 6min,弃去上层液体,下层液体过0.22μπι聚醚砜水系滤头过滤,获得从肝脏、肾脏、鳃、卵 巢组织中提取、净化后含Ν 4-乙酰基-磺胺甲噁唑可供HPLC-MS/MS分析的液体。
[0019] K、HPLC-MS/MS的分析条件:色谱柱:Hypersil GOLD C18色谱柱(150mmX2. lmm,5μ m);柱温:34 - 36°C,流速:0.2mL/min;流动相:有机相为试剂Β,水相为试剂C和试剂D的水溶 液。梯度洗脱程序:有机相与水相初始的体积比为20:80,维持lmin;从lmin到3min,有机相 与水相的体积比由20:80均匀变为45:55;从3. Omin到7.5min,有机相与水相的体积比45:55 维持不变;再从7.5min到7.6min,有机相与水相的体积比由45:55均匀变为20:80; 7.6min到 8.5min,有机相与水相的体积比维持20:80不变;进样量1(^匕
[0020] L、离子化模式:大气压电喷雾离子源(ESI ),正离子模式;检测方式采用选择反应 监测(SRM)模式;喷雾电压:3500V;蒸发气温度:48 - 52 °C ;鞘气压力35arb ;辅助气压力 5arb;碰撞气及压力:氩气(纯度2 99.999),1.5m Torr;离子传输毛细管温度:348 - 352°C ; Q1 PW 0.7,Q3 PW 0.7。母离
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