分子印记纳米磁珠分散固相萃取与质谱联用用于大鼠血浆中虎杖代谢物质群的检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种中药虎杖代谢物质群的检测方法，具体涉及一种基于分子印记纳米磁珠分散固相萃取与LC/Q-TOF-MS技术联用用于大鼠血浆中虎杖代谢物质群的检测方法。
【背景技术】
[0002]中药代谢产物的研究获得了全世界的广泛关注，因其具有潜在的活性成分或生物标记物用于疾病诊断和治疗反应。特别是目标代谢物群的研究，对阐明药效物质基础和中药的有效成分具有重要意义。然而，由于中药代谢产物群的成分多样性，作用复杂性，基质背景干扰，且缺少适当的分析方法，这一部分的研究是远远不够的。因此，对中药目标代谢物群的研究迫切需要一种综合的评价方法和先进的分析战略。
[0003]虎杖作为寥科植物虎杖Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.的干燥根莖和根，广泛分布在亚洲和北美等地区。由于本身具有保肝降血脂、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化等药理作用，尤其抗肿瘤活性，常常被作为肿瘤类和心脑血管疾病的化学预防剂。虎杖中富含以反式白藜芦醇苷(虎杖苷，口0]^(^1:；[11)为代表的苗类和以大黄素(61]10(1；[11)为代表的蒽醌类成分，在2010版中国药典中采用高效液相色谱法对上述两种指标成分进行质量控制。虎杖中的芪类成分主要为虎杖苷和反式白藜芦醇(trans-resveratrol)，具有显著的抗肿瘤、抗心脑血管疾病和神经保护的药理活性。虎杖苷及其苷元在体内代谢产物多为其葡萄糖醛酸苷或硫酸酯类化合物，其代谢产物的药理活性在不断深入研究和报道。虎杖中大黄素类成分的体内代谢研究表明，大黄素主要以原型、大黄素-0-8-13-D葡萄糖苷(emodin-8-0-13-D-glucoside)、大黄酸或大黄素甲醚等形式存在，其代谢产物具有显著的抑菌、保肝利胆、抗肿瘤和降血脂等药理活性。但目前研究仅能对原型及主要代谢产物进行定性定量分析，缺乏对体内外物质组的整体认识，从而导致一些微量的代谢产物往往检测不到或者丢失。为了更好地阐明其药效物质基础，需要一种选择性强专属性好的富集分离模式并建立基于整体观的体内外物质组表征方法。
[0004]目前，各种分析技术如LC-MS、LC_MS以及基于基质干扰、微量成分损失等问题相继出现的蛋白沉淀、液液萃取、固相萃取等样品预处理技术，已逐渐应用于中药代谢分析，但这些传统方法具有选择性低、干扰大、萃取效率低等缺点。因此，寻找一个有效的预处理方法和步骤对于减少干扰、提高灵敏度是至关重要的。
[0005]近年来，具有构效预定性、选择识别性和广泛实用性特点的分子印记技术(molecular imprinting technology，MIT)发展迅速，分子印记聚合物(molecularimprinted polymers，MIPs)对模板分子空间结构“记忆”效应和作用位点的“识别”作用，能够高选择性的分离富集复杂体系微量成分。MIT的基本过程包括:(I)印记模板分子与功能单体预聚合；(2)交联剂固定模板分子周围的预组装结合基团；(3)除去模板分子，留下具有特定识别位点且三维结构匹配的空穴。由于MIPs具有选择识别性、稳定性好及使用寿命长等优点，在环境分析、生物传感器等许多领域得到应用。且研究表明，MIPs不仅可对模板分子选择性识别，而且对结构类似物亦具有较好的亲和力和选择识别性。MIPs用于中药体内复杂代谢成分的高选择性分离和检测研究具有令人瞩目的广阔前景。
[0006]磁性分离技术是当今在生物化学和生物医学工程领域中发展起来一种新的分离技术。是基于磁性微球在外磁场作用下的磁泳运动，从而对目标物进行分离富集的技术，具有快速、高效、非玷污、集分离富集于一体等诸多优点。磁分离技术所面临的关键问题在于粒径大小均一、水中分散性好、磁响应性强、超顺磁性磁性材料的制备，以保证生物分离过程的重现性、可控性和高效性。本论文通过制备出具有高磁响应性的磁性纳米粒，为MIPs的制备省去离心、过滤等繁杂的操作，使其更加省时、方便。
[0007]未经修饰的磁性纳米粒表面因其缺少官能基团使其应用大大受到限制，对其进行树枝状分子修饰后，可获得高度枝化的三维结构，其结构含有众多具有相同微环境的端基官能团和非缠绕链段，可对树枝状聚合物进行各种端基改性，以满足多种应用需求。树枝状结构有良好的可控制性、高度的分枝、丰富的功能基团，与传统的线型聚合物相比，提供了较大的比表面积，这为MIPs的制备提供了较多的印记位点。
[0008]针对中药虎杖代谢产物的主要活性成分，发明人通过表面分子印记技术和磁性分离技术的交叉研究，制备出对虎杖苷、大黄素-8-0-13_D-葡萄糖苷具有高灵敏度、高选择性印记磁珠，针对中药体内代谢物质结构特点，采用相应的印记磁珠“垂钓”体内代谢物质群，实现中药虎杖总提取物给药后的“多靶标富集”，对目标群进行LC/Q-TOF-MS的鉴定与分析，这与传统的有效部位给药后分析代谢物质的方法相比，更充分考虑中药整体(包括复杂的基质背景)作用的特点，有望揭示虎杖“原型成分-代谢物质群-活性”的相关性，为中药代谢物质群的研究建立了一个有效的分析平台。
【发明内容】
[0009]本发明的目的在于克服上述不足之处，提供一种基于分子印记纳米磁珠分散固相萃取(MMIPs-DSPE)与LC/Q-TOF-MS技术联用用于大鼠血浆中虎杖代谢物质群的检测方法。
[0010]本发明的目的是通过以下方式实现的:
[0011]一种基于分子印记纳米磁珠分散固相萃取(MMIPs-DSPE)与LC/Q-TOF-MS技术联用用于大鼠血浆中虎杖代谢物质群的检测方法，其特征在于该方法包括以下步骤:
[0012](I)制备印记磁珠:a).将Fe3O4OS12纳米粒分散于甲苯中，加入硅烷偶联剂，氮气条件下加热回流12?48h，经磁性分离后，洗涤，真空干燥;氮气保护下，以甲醇为溶剂，依次与丙烯酸甲酯和乙二胺各反应I次，每次反应24?36h，得到纳米磁珠Fe3O4OEDA ； b)将Fe3O4OEDA分散于甲醇溶液，加入三羟甲基丙烷三丙烯酸酯(TMPTA)，氮气条件下加热回流6?36h，经磁性分离后，洗涤，真空干燥，得Fe3O4OTMPTA ；c).将模板分子虎杖苷、大黄素-8-0_i3-D-葡萄糖苷分别和Fe3O4OTMPTA置于致孔剂中室温下预聚l-2h，再加入甲基丙烯酸室温预聚0.5?2h，最后加入交联剂及引发剂，氮气保护下，依次在50°C下聚合6-24h后，60°C下聚合12-24h;d).所得聚合物分别用体积比为1:5-9的醋酸甲醇混合溶液洗脱模板分子，干燥，得到虎杖苷、大黄素-8-0-13-D-葡萄糖苷分子印记磁珠，分别记为ro-MMIPs、EG-MMIPs;
[0013](2)样品处理:按照给药量为4.0g/kg大鼠给药中药虎杖浸膏后，分别于给药后O分钟，5分钟，10分钟，30分钟，60分钟，90分钟，120分钟，180分钟取血样，将血样分别放于含有抗凝剂的小管中，离心后取上清液得血浆，将每份样品取出相同的量制成混合血浆;随后混合血浆处理如下:取两份混合血浆，分别加入其3倍体积的甲醇，经涡旋、离心，分别取上清液氮气吹干，溶剂复溶，再分别加入I3D-MMIPs和EG-MMIPs印记磁珠振摇，磁性分离，弃去上清液，甲醇洗去残留溶液后，加入解析溶液超声30分钟解析模板分子;优选涡旋振荡I分钟、^???!?/!!!样品分析:将上述解析液氮气吹干，复溶，利用LC/Q-TOF-MS对解析液进行半定量分析，鉴定中药虎杖的代谢物质群。复溶用流动相和参考物染料木素，流动相使用量为与染料木素使用量重量比为100:0.05-0.5。
[0015]步骤(3)中进行半定量分析采用的条件为:
[0016]高效液相条件:流动相A: 0.05 %甲酸水溶液；流动相B:甲醇溶液；色谱柱型号:Hedera 0DS_2C18column(4.6 X 250mm，5ym)；梯度条件:O-1Omin，30-40%B； 10_25min，40-60%B; 25-45min，60-80%B; 45-60min，80-85%B 或者 0-5min，15-25%B;5-15min ,25-35%8;15-2511^11，35-60%8;25-4511^11，60-70%8;45-6011^11，70-100%8或者0-1511^11，15-35%8;15-25min，35-60%B； 25_45min，60-70 % B ； 45_60min，70-80 % B ；流速:0.5ml/min ；柱温:25°C;进样体积:10μ1。
[0017]质谱条件:N2流速:10.01/min；N2温度:320°C ；雾化气:45psig；毛细管电压:3500
[0018]V;碰撞电压:120V;碰撞能:30V。
[0019]步骤(I)所述的Fe3O4OS12纳米粒与硅烷偶联剂用量的比例为1:(0.08?0.16) (g/mol) ο，娃烧偶联剂优选为y _氣丙基二乙氧基娃烧。
[0020]步骤(I)所述的丙烯酸甲酯与乙二胺的摩尔比为1:1，丙烯酸甲酯与硅烷