一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物检测领域，具体而言，涉及检测一种中性粒细胞明胶酶相关脂质 运载蛋白的检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 随着人民生活水平的不断提高，以及生活习惯和饮食习惯的逐渐改变，肾脏疾病 的发病率逐年增高。肾脏疾病大多继发于糖尿病、高血压、免疫伤害和细菌感染，其病因复 杂、病程迀延，并且增加心血管疾病的危险性，已经成为全球性公共健康问题。肾脏疾病可 分为两个主要的症候群--急性肾损伤（acute kidney injury，AKI)和慢性肾脏病 (chronic kidney disease，CKD) αΑΚΙ是指突发（l_7d)和持续（>24 h)的肾功能下降的一 组临床综合征，表现为氮质血症、水电解质和酸碱平衡紊乱以及全身各系统症状，可伴有少 尿或无尿，是临床常见的急危重症之一。AKI的总体发病率约为1%，而住院病人的发病率高 达15%，每年引起全球200万人死亡。越来越多的AKI远期预后研究显示，AKI与随后发生的 CKD具有显著地相关性，AKI可能导致CKD的发生。2012年，王海燕教授等在《柳叶刀》杂志上 发表的首个全国性CKD横断面调查表明，中国CKD患病率高达10.8%，患者预计近1.2亿，但知 晓率却仅为12.5%，且多数为肾功能明显受损时才发现。因此寻找一种可靠的生物标志物， 在肾脏疾病发展早期进行有效诊断，对其治疗和预后具有十分重要的临床意义。
[0003] 1993年，Kjeldsen等人在研究人类中性粒细胞明胶酶时，从活化的中性粒细胞的 上清液中分离纯化了一种25kD的蛋白质，并命名为中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白 (neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL)。后期的研究发现，NGAL具有多种 重要的生理作用，其异常表达对肾脏疾病的早期诊断和预后判断具有非常重要的意义。
[0004] NGAL主要由成熟粒细胞的前体细胞中幼粒细胞和晚幼粒细胞合成，存在于中性粒 细胞特殊颗粒中，除中性粒细胞外，NGAL在人类多种组织（如子宫、前列腺、唾液腺、肺、气 管、胃、结肠和肾等）的上皮细胞中均存在不同程度的表达。在正常肾组织中NGAL呈低水平 表达，当接触肾毒性物质或发生缺血性损伤后，皮质肾小管、血液、尿液中会出现NGAL大量 蓄积，并可在损伤后3小时的尿液和血清中检测到NGAL。虽然AKI在早期常常是可逆的，而且 治疗上也取得了很大的进步，然而发病率和病死率依然没有显著改善，原因就是无法早期 发现肾损伤。目前，肾脏疾病的诊断主要依赖血清肌酐（serum creatinine，Scr)，但Scr相 对AKI是一种不敏感且比较滞后的标志物。当AKI发展至Scr升高时，很可能就错过了治疗的 关键时期。这就促使人们寻找更敏感的标志物，而NGAL则是众多新标志物中最有潜力的一 种。NGAL参与肾脏的发生和发育，是急性肾损伤(Acute kidney injury，AKI)的早期标志 物。特别是在急诊科监测尿NGAL水平比依赖Scr水平升高能更好地评估AKI患者的病情，可 帮助临床医师决定是否需要肾脏专科医师会诊、收住ICU、行肾脏替代治疗(RRT)等处理，甚 至可以预测患者的病死率。研究显示，AKI患者血浆和尿NGAL水平比SCr提前一天达到高 峰，在全身严重性多发伤的患者中，创伤发生1天后检测尿NGAL发现，发生AKI的多发伤患者 尿NGAL浓度显著高于未发生AKI的患者，且这种高水平可持续2天。NGAL和Scr的受试者R0C 曲线预测AKI时，NGAL的曲线下面积(AUC)显著高于Scr。血浆NGAL高峰浓度随着AKI严重程 度的增加而增加。从急诊科收入院的患者，检测其血NGAL浓度还有助于预测在院期间的病 死率。在一项多中心前瞻性研究中，从急诊科收入院患者，连续采集血液标本，NGAL的AUC较 Scr和肾小球滤过率（GFR)更高。连续监测NGAL有较高的阴性预测值(98%)，能在患者到达 急诊科6小时内排除。
[0005] 随着NGAL研究进一步深入，研究人员发现NGAL不仅是AKI的血清标志物，还与慢性 肾脏疾病(CKD)的进展有关。在CKD患者中血浆NGAL水平显著升高，且和Scr及估算的肾小球 滤过率(eGFR)相关性较强，是反映 CKD进展的独立风险因素。有研究证明，肾小管在CKD的发 生及发展中起到关键作用一一引起进行性肾功能破坏的致病机制的一个共同特点是作用 于肾小管间质途径的肾小管萎缩和缺氧，肾小管周围毛细血管损伤和间质纤维化，最终演 化为不可逆的终末期尿毒症。根据这一观点，肾小管间质的损伤与肾小球病变的严重程度 相比，能够更准确的反映肾脏损伤的速率及程度。损伤的肾小管上皮细胞表达的NGAL可诱 导肾小管间质中浸润的中性粒细胞发生凋亡以保护肾组织免受炎细胞的损害。同时诱导肾 间充质细胞向肾小管上皮细胞转化，促进肾小管上皮细胞再生，抑制肾脏纤维化等，这可能 是机体在肾脏缺血再灌注损伤后启动的一种保护机制，所以在肾脏损伤的早期NGAL水平保 护性升高。在缺血和肾毒性损害的动物肾脏模型中，应用基因芯片技术分析发现，NGAL是出 现最早和表达最显著的基因和蛋白之一，很容易在血液和尿液标本中检测到其升高，因此 NGAL可作为CKD早期筛查的指标。至今，早期CKD诊断仍然主要靠 GFR相关实验室检查给予临 床医生提示。然而，如以现有的肾功能检测手段发现异常，大多数病人已经丢失了 50%以上 的肾功能，以至于很多患者错过了最佳的治疗时机。为此，寻求简便、快速、准确的GFR实验 室检测方法或指标势在必行。NGAL能迅速、灵敏、特异的反映肾脏损伤及修复过程。NGAL相 对其他指标能够更准确的评估CKD患者的GFR，反映 CKD的病情进展及严重程度。
[0006] 为了更好地研究NGAL的生物学功能，建立高灵敏、高特异性的NGAL检测方法是一 件非常有意义的事情。NGAL的检测最初采用Western Blot法，但由于该方法灵敏度和精密 度低、操作复杂、重复性差等缺点现在已很少用于NGAL的定量研究。2005年丹麦BioPorto公 司首先推出EL ISA商品试剂盒，可用于血清(浆）、尿液的NGAL检测，标本量需1 OOyL，检测周 期约4h，检测限达到0.1ng/ml。但是ELISA的方法因手工操作，不只是检测步骤繁琐、样本 周转时间长，而且影响因素较多，重复性也不够好，更与操作人员的熟练程度和手法的一致 性有很大的关系，逐渐被自动化的化学发光检测系统替代，如美国雅培公司的Architect i2000SR全自动免疫分析仪测定尿液NGAL(化学发光微粒子免疫分析法），标本量需150yL， 检测周期约28min;美国博适公司的Triage分析仪检测EDTA抗凝血衆或全血(双抗体夹心免 疫荧光层析法），15min即可完成NGAL的测定，检测范围50~2000ng/mL。但是这些检测系统 只能单一的检测尿液或者血浆，标本用量大，且仪器本身以及配套试剂都极其昂贵，限制了 其在临床的常规应用。
【发明内容】
[0007] 本发明所要解决的技术问题是提供一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的 检测试剂盒，该试剂盒灵敏度高、线性范围广、精密度好，可以检测血清和尿液里中性粒细 胞明胶酶相关脂质运载蛋白含量，适用于全自动生化分析仪。
[0008] 本发明解决上述技术问题所采用以下技术方案。
[0009] 本发明中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的检测试剂盒包括试剂1和试剂2;所 述试剂1包括：10-100 mmol/L的缓冲液、0.1-1%W/V的增浊剂、0.01-0.05%w/v的防腐剂;所 述试剂2包括:0.1-0.5%w/v标记有抗人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体的致敏胶 乳颗粒、0. l-5%w/v的稳定物质、10-100 mmol/L的缓冲液、0.01-0.05%w/v的防腐剂。
[0010] 所述的胶乳颗粒直径分别为50~100 nm和200~400nm。优选直径分别为60 nm~ 80nm和 250-300 nm。
[0011] 所述缓冲液为磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液、MES中的 一种或多种;所述缓冲液pH值为6.5-8.5。所述缓冲液可以为其他具有相似特征的缓冲液。
[0012] 由于抗体分子的特殊性，需要有稳定物质保持其结构和活性的稳定。所述的稳定 物质为生物大分子、高分子聚合物等其中的一种或多种;生物大分子为牛血清白蛋白或糖 类物质，糖类包括蔗糖、海藻糖、葡聚糖、甘露糖和葡萄糖中的一种或多种;所述的高分子聚 合物为聚乙二醇或聚乙稀醇。所述试剂2中的稳定物质优选为0.1 _5%w/v的牛血清白蛋白 BSA〇
[0013] 为了防止试剂受到微生物的污染，本发明试剂1和试剂2中分别添加了适量的防腐 剂，防腐剂是叠氮化钠、硫柳萊、Proclin300、卡松中的一种或多种。优选的，本发明防腐剂 为0 · 01 -0 · 05%w/v的叠氮化钠。
[0014] 本发明试剂盒中，所述试剂2的制备具体地可以采用以下方法制备，包括以下步 骤。
[0015] 步骤1:制备活化的胶乳悬液：向1 mg胶乳微粒中加入〇·卜0.2 mL的5 mg/mL的EDC 和0.1-0.2 1^的5 11^/1^的順5;在20-25°(：下震荡反应30 111丨11;离心后，用50臟〇1/1的磷酸 盐缓冲液(pH=7.4)冲洗反应后的悬浮颗粒，以除去多余的未反应的EDC和NHS，得到活化的 胶乳悬液；所述胶乳微粒由两种粒径的胶乳颗粒组成，优选直径分别为60 nm~80nm和 250-300 nm。
[0016] 步骤2:制备稀释的抗体溶液:将抗中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体用50 mm〇l/L的磷酸盐缓冲液(pH=7.4)稀释至1 mg/mL;得到稀释的抗体溶液。
[0017] 步骤3:向所述步骤1制备得到的活化后的胶乳悬液中加入所述步骤2制备的稀释 的抗体溶液10 yL，室温20-25°C下反应2h。
[0018] 步骤4:将步骤3处理后所得溶液离心用10%(w/v)BSA进行封闭，室温20-25Γ反应 lh〇
[0019] 步骤5:将步骤4所得溶液离心后悬浮于溶液A中，所述溶液A含0. l-5%w/v的稳定物 质、10-100 mmol/L的缓冲液(pH=8.0)、0.0卜0.05%w/v的防腐剂;所述免疫胶乳在溶液A中 的浓度为 〇 · 1%_〇 · 5%(w/v)。
[0020]优选地，所述溶液A含 10 mmol/L磷酸盐(pH=8.0)、l% (w/v)BSA和0