磷光报告物的制作方法

磷光报告物的制作方法
【专利说明】磯光报告物
[0001] 关于联邦资助研究/开发的声明
[0002] 本发明是在政府支持下由国家卫生研究院授予的基金号U54 AI057156资助完成。 政府对本发明拥有某些权利。
[0003] 相关申请的交叉引用
[0004] 本申请要求2013年8月19日向美国专利商标局提交的美国临时专利申请号61/ 867，263的优先权，其全部内容通过引用纳入本文。
[00化]戦
[0006] 已经使用各种测试和检测方法来特异性检测不同应用中的多种类型的分析物，如 医学诊断、食品安全和质量保证、W及环境监测。现有的利用分析报告物的方法和系统在低 资源设置中的成本、效率、灵敏度、通用性和可配置性方面存在多种限制。因此，需要更有效 的技术和传感方法来克服运些限制。
[0007] 发明概述
[000引在一些实施方式中，本发明设及包含憐光报告物的物质的新组合物。在一些实施 方式中，憐光报告物是小憐光颗粒，如无机憐光体。在一些实施方式中，无机憐光体具有超 过10微秒，并优选超过1分钟的发光寿命。在一些实施方式中，无机憐光体具有足够长的寿 命使得可用合适激发波长的光源简短地激发颗粒，然后W足够高的强度W比激发源更长的 波长发光，并在激发后持续足够长的时间用于时间分辨发光测量或成像。
[0009] 在一些实施方式中，本发明的憐光报告物包括侣酸锁。在一些实施方式中，侣酸锁 渗杂館和铺(SrAb〇4:Eu2%Dy 3+)或一种或多种稀±金属的组合，优选铜系。在一些实施方式 中，本发明的憐光报告物包括通过在无机基质材料（inorganic host material)中合适地 渗杂稀±或过渡金属产生的无机憐光体。在一些实施方式中，无机基质材料可包括，但不限 于，硫化锋、硫化巧、碱±金属娃酸盐(例如，娃酸被、娃酸巧、娃酸儀和娃酸领）、碱±金属侣 酸盐（例如，侣酸巧、侣酸儀、侣酸被和侣酸领儀）、铁酸盐（例如，铁酸巧、铁酸儀、和铁酸 铅），及其组合。在一些实施方式中，本发明的憐光报告物可包括渗杂金属W改变电子结构， 生成憐光的无机金属氧化物基质材料。
[0010] 在一些实施方式中，可用阻隔物或壳，如娃基壳（例如，氧化娃、二氧化娃、娃酸盐 或有机官能硅烷），氧化侣，其他无机金属氧化物，高度交联的聚合物网络，及其组合来被覆 或包封憐光报告物。在一些实施方式中，覆层或包封可有助于防止由与周围环境中的水或 化学物，或化合物的反应导致的憐光忍的发光性质的损失或降解。在一些实施方式中，可通 过Stober法或S识ber法的修改形式来进行被覆或包封。
[0011] 在一些实施方式中，可用水溶性部分，如聚乙二醇或亲水性聚合物被覆或功能化 本发明的憐光报告物W使得所述报告物易于在水或水性溶液中分散。在一些实施方式中， 可用降低分析试验或测试中的非特异性结合的部分被覆或功能化憐光报告物。
[0012] 在一些实施方式中，可用分子识别元件，如抗体或适体来修饰本发明的憐光报告 物。在一些实施方式中，分子识别元件可共价连接至憐光报告物。在一些实施方式中，分子 识别元件可非共价连接至憐光报告物，如通过物理吸附。
[0013] 在一些实施方式中，本发明的憐光报告物可与接头相联，如=乙氧基甲娃烷基下 醒(TESBA)、聚乙二醇(PEG)、（3-氨丙基)S乙氧基硅烷(APTES)、烧控等。在一些实施方式 中，与二氧化娃表面结合并且也具有与其他分子偶联的官能基团的反应性硅烷接头可附于 憐光报告物的表面。在一些实施方式中，市售的带有用于与蛋白质偶联的反应性官能基团 的=烷氧基硅烷聚乙二醇分子可直接连接至憐光报告物的无机二氧化娃或氧化侣表面。在 一些实施方式中，可在用水溶性部分被覆憐光报告物之前、期间或之后将接头偶联至憐光 报告物。例如，在一些实施方式中，憐光报告物可用反应性硅烷被覆，并随后用聚乙二醇偶 联。
[0014] 在一些实施方式中，可用其表面上的各种官能团官能化憐光报告物。示例性的官 能团包括，但不限于，胺基、簇基、醒、酬、径基、硫醇、酷阱、酸酢、締控、烘控、叠氮化物，及其 组合。在更具体的实施方式中，官能化的憐光报告物可直接偶联至通过用高舰酸盐氧化抗 体Fc部分上的多糖在抗体上产生的醒。在其他实施方式中，特异性结合抗体的Fc部分的蛋白 A或其他蛋白质可连接至憐光报告物的表面，并然后用于W定向的方式结合抗体，W改善憐 光报告物的结合效率。
[0015] 在一些实施方式中，憐光报告物可W是颗粒的形式。在一些实施方式中，颗粒的尺 寸范围是约 1 OOOnm、600nm、400nm、300nm、200nm、1 OOnm 或 50nm。
[0016] 本发明的其他实施方式设及制备前述憐光报告物的方法。在一些实施方式中，该 方法包括，通过湿研磨和沉降联用来减小无机憐光粉末的尺寸。例如，在一些实施方式中， 用球磨机或罐磨机进行湿研磨。然后，将干燥无机憐光粉末分散在液体中，并在研磨介质 (例如，由坚硬、致密材料如氧化错组成的研磨介质)存在下放置在陶瓷、金属或塑料研磨罐 中并研磨。
[0017] 在一些实施方式中，在有机溶剂如乙酸乙醋、甲苯、环己烧、环戊烧、癸烧及其组合 存在下进行湿研磨。在一些实施方式中，有机溶剂是疏水性的并且具有低吸湿性。在一些实 施方式中，有机溶剂并不影响无机材料的发光。在一些实施方式中，在醇，如乙醇、异丙醇、 下醇或其组合存在下进行湿研磨。
[0018] 在其他实施方式中，可使用替代性研磨技术和设备来减小无机憐光粉末的平均粒 度。在一些实施方式中，运类技术包括，但不限于，冷冻研磨、振动研磨、珠磨、干燥研磨、磨 擦研磨、喷射研磨、磨碎及其组合。在一些实施方式中，可使用除沉降W外的分级分离 (打act ionat ion)技术(例如，筛分、场流分级分离、切向流分离)来分离更窄的粒度分布。
[0019] 在一些实施方式中，本发明设及一种用于检测样品内至少一种分析物的方法。运 种方法包括提供憐光报告物的步骤。在一些实施方式中，该方法还包括将憐光报告物与样 品接触。在一些实施方式中，该方法包括检测憐光报告物的发光信号的步骤。在一些实施方 式中，该方法包括确定分析物存在并基于检测到的发光信号对分析物进行定量的步骤。
[0020] 在一些实施方式中，本发明设及一种用于体外检测样品内至少一种分析物的方 法。运种方法包括提供憐光报告物的步骤。在一些实施方式中，该方法还包括将憐光报告物 加载到多孔材料中。在一些实施方式中，该方法包括将样品与加载了憐光报告物的多孔材 料接触。在一些实施方式中，该方法包括使样品和憐光报告物流动通过多孔膜。在一些实施 方式中，该方法包括检测膜上的发光区域或发光的缺失，W指示存在或缺少至少一种分析 物。
[0021] 在一些实施方式中，本发明设及一种用于体外检测样品内至少一种分析物的方 法。运种方法包括W下步骤:提供憐光报告物;并提供固定在表面上的至少一种第一分子识 别元件，其中固定的分子识别元件能够结合至至少一种分析物。在一些实施方式中，该方法 还包括将样品与表面接触W允许至少一种分析物结合分子识别元件，W固定分析物。在一 些实施方式中，该方法包括将憐光报告物与表面接触，W使憐光报告物结合至少一种固定 的分析物;并且测量来自憐光报告物的发光信号，W允许检测或定量分析物。
[0022] 在一些实施方式中，所述表面包括微流体忍片，或纸微流体，或膜，或微板，或用于 浮选的微气泡、或透明表面。在一些实施方式中，憐光报告物包括至少一种无机憐光颗粒、 包封至少一种憐光颗粒的壳，和位于壳上的第二分子识别部分。在一些实施方式中，第二分 子识别部分结合至少一种固定的分析物W生成发光信号。
[0023] 在一些实施方式中，本发明设及磁性憐光报告物。在一些实施方式中，磁性憐光报 告物包括至少一种无机憐光颗粒。在一些实施方式中，磁性憐光报告物包括包封至少一种 无机憐光颗粒的壳和位于壳上的至少一种磁性部分。在一些实施方式中，磁性憐光报告物 包括位于壳上的至少一种分子识别部分。在一些实施方式中，无机憐光颗粒形成憐光报告 物的忍。
[0024] 在一些实施方式中，磁性憐光报告物包括至少一种无机憐光颗粒和至少一种磁性 颗粒或磁性材料层。在一些实施方式中，壳包封至少一种无机憐光颗粒和至少一种磁性颗 粒或磁性材料层。在一些实施方式中，磁性憐光报告物包括位于壳上的至少一种分子识别 部分。在一些实施方式中，无机憐光颗粒和至少一种磁性颗粒或磁性层形成憐光报告物的 忍。
[0025] 在一些实施方式中，本发明设及一种用于检测样品内至少一种分析物的方法。运 种方法包括提供磁性憐光报告物。在一些实施方式中，磁性憐光报告物包括至少一种无机 憐光颗粒和至少一种磁性颗粒或磁性材料层。在一些实施方式中，磁性憐光报告物还包括 包封至少一种无机憐光颗粒和至少一种磁性颗粒或磁性材料层的壳。在一些实施方式中， 报告物包括针对位于壳上的分析物有特异性的至少一种第一分子识别部分。
[00%]在一些实施方式中，该方法还包括将前述磁性憐光报告物与样品接触。在一些实 施方式中，该方法包括通过使用磁场来浓缩磁性憐光报告物。在一些实施方式中，该方法包 括将浓缩的磁性憐光报告物与表面接触。在一些实施方式中，用针对分析物有特异性的至 少一种第二分子识别部分来使表面功能化。在一些实施方式中，该方法还包括检测磁性憐 光报告物的发光信号;和，基于检测到的发光信号来确定分析物存在或对分析物定量。在一 些实施方式中，第一分子识别部分结合至少一种分析物W生成发光信号。
[0027]在其他实施方式中，本发明设及在各种方案设置(setting)中，如诊断方案设置中 检测憐光报告物的方法(例如，图31)。在一些实施方式中，该方法包括检测来自憐光报告物 的发光。在一些实施方式中，可通过激发憐光报告物来检测来自憐光报告物的发光。在多个 实施方式中，可通过电子、磁场、光子或其组合来激发憐光报告物。在一些实施方式中，使用 波长选择性机制在激发的同时检测发光。在一些实施方式中，可通过施加热来增强发光。在 一些实施方式中，可在激发停止的1、10、100、1000或10000000毫秒内检测到发光。在一些实 施方式中，可通过电子机制、光学机制、光电子机制、机械遮蔽、旋转、流动或重新定位机制 来检测发光。
[0028] 在一些实施方式中，通过用膜基或数字照相机(例如，带CM0S、CCD或其他类型的传 感器的数字照相机)成像，发光被用来定性或定量地获得试验中的信号。在一些实施方式 中，可用发光计、巧光计、分光光度计或能够测量光强度的其他类似设备来测量发光。
[0029] 在一些实施方式中，可使用手机，智能手机，或便携式电子装置，诸如但不限于平 板电脑、个人数字助理或笔记本电脑来检测来自憐光报告物的发光，用于定性或定量试验 读取。在一些实施方式中，手机或便携式电子装置可与附属装置禪合，W允许检测来自憐光 报告物的发光，W检测来测试样品中是否存在分析物。
[0030] 在一些实施方式中，本发明设及增强憐光报告物的检测的方法。在一些实施方式 中，使用平均技术，如图36-40所示的那些来在检测分析物是否存在的试验中实现来自所用 憐光报告物的发光信号的更高信噪比。
[0031] 在一些实施方式中，可在多种试验方案设置中使用本发明的憐光报告物。在一些 实施方式中，试验方案设置可包括但不限于，横向流动，表面-结合试验，流通试验，与漂浮 材料相关的试验，或用于浓缩或力压缩的与磁性材料相关的试验。在一些实施方式中，本发 明设及包含憐光报告物的物质和多孔膜(诸如但不限于硝酸纤维素、玻璃纤维和棉花纤维） 的组合物。在一些实施方式中，在用于分析物检测的试验中使用包含憐光报告物的物质和 多孔膜的组合物。
[00创附图的简要说明
[0033] 图1显示了在不同波长下发射的侣酸锁憐光粉末的不同样品。材料的不同颜色允 许进行基于光谱的多重试验。
[0034] 图2显示了购得的侣酸锁憐光粉末的能量色散X-射线光谱化DS)数据，标出了 C、0、 Al、Dy、S;rXa、Eu 和 Dy 的峰。
[0035] 图3A-3B显示了各种方案。示意性地显示了用于通过一般罐磨机或球磨机减小憐 光颗粒的尺寸的研磨工艺（图3A)。绘图显示了可能会在研磨期间导致压裂和尺寸减小的颗 粒的各种缺陷（图3B)(改自陶瓷加工原理介绍（Introduction the Principles of Ceramic Processing)-]".Reed，1988)。
[0036] 图4显示了用Retsch MM301高速混合研磨机在不诱钢研磨罐中在乙醇中湿研磨之 后侣酸锁憐光粉末的图像。侣酸锁显示对于不诱钢球和罐而言磨蚀性太强，导致钢颗粒明 显污染产品，产生灰色。用其他研磨流体来进行实验，W确保污染是来自对钢物理磨损的机 械作用，而不是化学现象。
[0037] 图5显示了侣酸锁憐光颗粒的光学显微图像。（A)最细级别的市售侣酸锁粉末，有 效颗粒直径超过SOwiiD(B)湿研磨后侣酸锁憐光颗粒产生直径低于IOwii的颗粒。
[0038] 图6显示了研磨的侣酸锁憐光颗粒的扫描电子显微镜(SEM)图像。相当大部分的颗 粒具有亚微米直径。
[0039] 图7显示了绿色侣酸锁憐光体的发射光谱，W及在激发后几秒拍摄的研磨的憐光 颗粒的胶体分散体的照片。研磨的颗粒没有快速沉降，并且也保留了长的发光寿命。
[0040] 图8显示了研磨的和尺寸分级的侣酸锁憐光体的粒度分布。用悬浮的微通道共振 器设备来获得数据。
[0041 ] 图9显示了四乙氧基硅烷(TEOS)和水反应生成二氧化娃，并显示随着二氧化娃层 随时间的生长，初始半径为ro且总半径为r(t)的憐光颗粒的二氧化娃包封的示意图。
[0042] 图10显示了四乙氧基硅烷及其在二氧化娃包封过程中的水解产物的瞬时浓度的 模型预测。显示了初始水浓度的两种不同的起始条件。（左）5体积％的起始水浓度。（右)20 体积％的起始水浓度。
[0043] 图11显示了随时间变化的、针对初始水浓度的不同起始条件计算的环绕起始直径 为500nm的颗粒周围的二氧化娃壳厚度。
[0044] 图12显示了用不同摩尔比的水与四乙氧基硅烷的二氧化娃包封实验的结果。来自 不同包埋方案的颗粒在纯水中重悬，W形成相同浓度的胶体，并且测量随时间变化的发光 W观察二氧化娃壳对防止水解的效果。（左)20mM四乙氧基硅烷，0.5M氨，（右)40mM四乙氧基 硅烷，0.5M氨。
[0045] 图13显示了裸的未包封的侣酸锁憐光颗粒和二氧化娃包封的侣酸锁憐光体的XPS 谱。
[0046] 图14显示了二氧化娃包封的侣酸锁憐光体，和用中性亲和素(Neu化Avidin)功能 化的二氧化娃包封的憐光体的谱。
[0047] 图15显示了 PEG官能化的二氧化娃包封的侣酸锁憐光体的粒度分布。用尺寸可调 纳米孔设备(IZON)来获取数据。
[004引图16是显示使二氧化娃包封的憐光颗粒与S乙氧基甲娃烷基下醒(TESBA)反应， W引入供于部分与表面的共价连接的表面醒的反应的示意图。
[00例图17显示了通过由TESBA引入的表面醒和来自蛋白质的胺之间的还原胺化而带有 偶合至表面的抗体的二氧化娃包封的憐光报告物的示意图。
[0050] 图18A-18B显示了用如图17所示功能化的抗-溶菌酶曲肥心5憐光报告物进行的憐 光体LFA实验。2个标记V'的LFA试条具有通过将鸡蛋溶菌酶直接点样在硝酸纤维素膜上制 备的测试线。标记的试条是没有溶酶体的阴性对照。亮场照明下的LFA试条（图18A)。光 激发和发光成像模式之后的LFA试条(图18B)。
[0051] 图19显示了采用抗-溶菌酶Dl.3测试线的憐光体LFA实验。在特定浓度下使用鸡蛋 溶菌酶化EU牛血清白蛋白（BSA)作为分析物。如图17所示的功能化的抗-溶菌酶曲肥心5憐 光颗粒用作报告物。
[0052] 图20显示了用在所有试条中用鸡蛋溶菌酶直接点样在膜上作为测试线的憐光体 LFA实验。（左)抗-溶菌酶曲肥心5憐光体用作报告物(右)二氧化娃包封的憐光体用作对照， W评价表面部分对憐光报告物通过膜的运输的影响。
[0053] 图21显示点样在化Sion 5玻璃纤维膜上的溶菌酶测试线的憐光体LFA实验，有6个 重复。抗-溶菌酶曲肥心5憐光体用作报告物。
[0054] 图22A-22C显示，利用用来自TESBA的憐光体上的表面醒的还原性胺化作用，用生 物素-PEG-胺官能化的憐光报告物的示意图（图22A)。用中性亲和素测试线官能化并且用生 物素-PEG憐光体作为报告物运行的LFA试条的亮场图像（图22B)。显示来自结合的生物素-PEG憐光报告物的测试线的发光的LFA试条的暗场图像（图22C)。左起第2试条和第4试条没 有用憐光体点样，W显示从第1试条和第3试条的测试线发出的光来自憐光体而不是来自在 测试线上吸附的蛋白质。
[0055] 图23显示了带有通过带末端簇酸基团的接枝PEG部分与抗体上的伯氨基之间的碳 二亚胺化学反应形成的酷胺键共价连接的抗体的憐光报告物。阳G通过与来自TESBA的醒的 还原性胺化作用枝接憐光报告物。
[0056] 图24是显示通过抗-溶菌酶抗体和中性亲和素憐光报告物之间的夹屯、法检测生物 素化的溶菌酶的示意图。
[0057] 图25显示了生物素化的溶菌酶分析物、曲肥心5现聯线、中性亲和素-PEG憐光报告 物，和生物素化的BSA对照线的LFA实验。
[005引图26显示了图25中LFA实验的重复，还测试了其它的更低分析物浓度。
[0059] 图27显示了用如图25和图26所示的中性亲和素憐光报告物和生物素化的溶菌酶 作为分析物，但在测试线Dl.3处采用不同的单克隆抗-溶菌酶抗体的LFA实验。
[0060] 图28显示了采用图27所示的中性亲和素憐光体、生物素化的溶菌酶分析物、Dl. 3 测试线和生物素化的BSA对照线，但采用脱脂奶粉纯化(passivize)的膜的LFA实验。
[0061] 图29显示了憐光报告物的时间口选或时间解析的发光试验的原理。在一段起始时 间中，来自憐光颗粒和背景的光强度接近0。应用激发光源导致来自憐光报告物的发光增 加，并且背景发光同时含有自体巧光和散射的激发光。当关闭激发光时，背景迅速衰减，而 憐光报告物信号缓慢衰减，产生更高的信背比和较低的检测限。
[0062] 图30显示在方案的进一步优化之后用图25和图26所示的中性亲和素憐光报告物 的LFA实验。检测限接近10化g/mL。
[0063] 图31显示横跨来自图30所示的实验的LFA试条的宽度的测试线强度概况。该图显 示了对分析物浓度定量的潜力并且有助于证明低检测限。
[0064] 图32A-32B显示了检测生物素化溶菌酶的LFA中的憐光报告物和金纳米颗粒的比 较。图32A和图32B是独立试验。
[0065] 图33显示了生物素化的溶菌酶分析物和憐光报告物的LFA实验的定量分析。作图 显示了测试线与对照线的强度比随分析物浓度的变化。
[0066] 图34是显示用固定在表面上的捕获抗体和憐光报告物，在夹屯、免疫试验中检测任 意分析物的一般示意图。
[0067] 图35A-35B显示了用于检测分析物的憐光报告物的浮选试验。浮动的物体，如玻璃 微泡，用抗体功能化并且结合至分析物，所述分析物由于浮动物体的漂浮而再位移至液体 顶部（图35A)。检测到来自液体顶部的发光，并且，通过液体内的染料吸附来封闭来自未结 合的憐光报告物的背景发光。SBl图像显示在预浮选分析试验实验中结合至玻璃微泡的憐 光报告物(图35B)。
[0068] 图36A-36B显示沿侧流试条的长度向下的线扫描（line scan),其用中性亲和素憐 光报告物和用作分析物的Ing/mL生物素化的溶菌酶运行。用iPhone 5s获取图像。从来自单 一图像的侧流试条的中间开始线扫描（图36A)。从同一侧流试条的中间开始，但来自40个图 像的平均的线扫描显示了源自图像平均化的噪音减少(图36B)。
[0069] 图37显示了用于获得高信噪比的LFA试条的线扫描的图像平均化的替代性方法， 使用采用了与图36相同的中性亲和素憐光报告物和Ing/mL的生物素化的溶菌酶分析物的 模型系统。在运种情况中，单一图像取自侧流试条，并且对沿该单一图像的试条的长度向下 的多个线扫描进行平均化。
[0070] 图38显示了图37所示的成像平均化方法，但是分析物浓度为0.1 ng/mL。在单个线 扫描中，噪音遮蔽了测试线，但是在通过平均化多个线扫描来减少噪音之后，来自测试线的 信号变得易于区分。
[0071] 图39A-39B显示了用iPhone 5s获取的，采用O.lng/mL生物素化的溶菌酶和中性亲 和素憐光报告物运行的LFA试条的灰度图像。图39A显示了单个图像。图39B显示了 16个图像 的平均化。
[0072] 图40A-40B显示了检测Ing/mL生物素化的溶菌酶的中性亲和素憐光报告物的LFA 结果。用iPhone 5s获取的40RGB色图像的平均图像(图40A)。相应的强度概况(图40B)。
[0073] 图41显示用于检测分析物的本发明的优选方法和实施方式。憐光报告物应用在侧 流试验中，在分析物存在下结合在测试线处。对照线确保试验正常发挥功能。憐光报告物加 载在偶联垫中，该偶联垫连接至样品垫。吸收垫发挥槽的作用W辅助通过测试条忍吸液体。
[0074] 图42显示了具有电子发光读取的侧流试验。侧流试条被部分或完全地夹屯、于2个 电极之间，其中至少一个是透明的W允许光透过。在电极之间施加恒定