一种用于检测三阴性乳腺癌瘤内异质性的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及乳腺癌预后预测因子领域，尤其涉及定量检测乳腺癌患者瘤内异质性的方法，具体的说，是一种用于检测三阴性乳腺癌瘤内异质性的方法。
【背景技术】
[0002]乳腺癌是常见恶性肿瘤之一。根据WHO最新统计数据，我国每年新发女性乳腺癌患者约18万，位居女性恶性肿瘤发病率第二，其治疗和预后预测受到大家的广泛关注。
[0003]乳腺癌是一种异质性很高的疾病，其预后与不同亚型(ER、PR、HER-2受体状态)、肿瘤分期、增殖指数(K1-67)、组织学分级等因素密切相关。然而在以上因素一致的情况下，尤其对于ER、PR、HER-2均为阴性的三阴性乳腺癌(TNBC)这一预后最差的乳腺癌亚型，不同患者间的预后仍存在差异。因此人们在不断探索新的、有效的预后预测指标，以准确判断患者复发和转移风险，及时调整治疗策略。
[0004]除了不同亚型的乳腺癌治疗和预后存在差异，肿瘤内部也具有很高的异质性，且有研究表明，肿瘤的瘤内异质性与疾病的诊断、治疗和预后密切相关。例如，同一患者不同部位的肿瘤组织荧光原位杂交检测HER-2扩增结果可能不一致，这有可能会影响临床检测的结果和治疗方案的制定。因此评估乳腺癌的异质性显得尤为重要。然而，目前尚没有统一的定量检测肿瘤瘤内异质性的方法，且目前大多数研究方法存在以下不足:
1.针对肿瘤内部的这种空间异质性，临床常需要多点取材，然后对单个样品分别进行基因分子水平的分析，整个过程时间成本、经济成本、人力成本均大大增高，同时也会增加实验误差。
[0005]2.目前较为先进的探究瘤内异质性的方法包括全基因表达谱、全基因组或外显子测序，甚至有的进行单细胞测序，以上方法经济成本和技术要求极高，大范围推广和普及很难实现，缺乏实用性。
[0006]3.目前通过瘤内异质性判断肿瘤预后没有统一的标准，且尚未在三阴性乳腺癌中加以应用。
【发明内容】
[0007]为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种成本低、误差小、能对多组样本同时检测的用于检测三阴性乳腺癌瘤内异质性的装置及方法。
[0008]为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为:
一种用于检测三阴性乳腺癌瘤内异质性的方法，其特征是:包括以下步骤:
步骤一、三阴性乳腺癌瘤内异质性检测芯片的制作:
1)制作受体蜡块:
在石蜡包埋机下，用模具制备受体蜡块;采用组织取样针在受体蜡块上打孔，相邻孔芯之间具有一定间隙，使孔芯在受体蜡块上形成微阵列；
2)供体蜡块取材: 收集数组所需检测的三阴性乳腺癌组织及配对正常组织石蜡标本作为供体蜡块;每组供体蜡块制切片后均进行H&E染色，观察组织结构典型的乳腺癌区，并在玻片上圈出，对照H&E染色切片，在供体蜡块相应部位上作出标记;在组织芯片制作仪上用同一直径的取样针对供体蜡块标记部位进行取样，一组取数个不同位置的癌组织和一个正常对照组织的组织芯；
3)瘤内异质性组织芯片制作:
将每组供体蜡块上取得的组织芯按一定排布规律，垂直塞入受体蜡块对应位置的空白孔芯中；将做好的组织芯片放回蜡块模中，加热至半熔后，将组织芯片冷却，再加热至半熔，重复数次，使组织芯与受体蜡块紧密结合;然后将组织芯片表面修平;将组织芯片切片并进行H&E染色，再次确认取材点是否与供体蜡块标记的目标区域相同；
步骤二、多探针联合荧光原位杂交:
I)探针选择:采用两个双色探针和一个单色探针进行三阴性乳腺癌瘤内异质性的检测;每个探针单独进行荧光原位杂交，步骤相同，具体如下:
a、切片预处理:将制作好的组织芯片切片，将切好的白片保温，过夜;次日室温二甲苯中脱蜡，再对切片浸洗处理，自然晾干玻片；
b、变性杂交:避光下滴加探针覆盖切片目标区域，加盖盖玻片并用树脂胶封边，放入杂交仪过夜；
c、洗涤复染:避光下取出玻片，揭去封胶，室温浸于SSC液中使盖玻片自然脱落，对玻片浸洗处理，自然晾干玻片，滴加DAPI封片，放置15min后于荧光显微镜下观察并拍照；
步骤三、计算瘤内异质性
1)每个点计数多个轮廓清晰、与周围细胞没有重叠、荧光信号清晰的细胞，记录下每个细胞内部红色信号和绿色信号的个数，每个细胞可计算其拷贝比值；
2)将每组细胞的信息进行汇总，计算每组的瘤内异质性指数，具体公式为:
H， = -Σ pi ln(pi),
其中Pi代表第i个拷贝值的细胞在所有细胞中所占的比例;每组将三个探针的H ’求和得出总的瘤内异质性指数H。
[0009 ]为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为:
步骤一中制作的受体蜡块用于制备尺寸为25.0mm X 23.8mm X 5.0mm的组织芯片，组织取样针直径为1.0mm，组织取样针在受体蜡块上打孔深度约为0.4cm，每两个相邻孔芯的间距约2.0mm，制备成8行X8列的微阵列。
[0010]步骤一中收集十六组所需检测的三阴性乳腺癌组织及配对正常组织石蜡标本作为供体蜡块，对供体蜡块标记部位进行取样时，一组取三个不同位置的癌组织和一个正常对照组织的组织芯，四个样本在受体蜡块上从左到右依次相邻排列在同一行，十六组组织芯填满受体蜡块的8行X 8列的微阵列。
[0011]步骤一中组织芯塞入受体蜡块的空白孔芯中后，将做好的组织芯片放回蜡块铅模中，放入56°C烤箱加热20min至半熔，在将组织芯片取出在室温下自然冷却，再放入烤箱加热，重复上述步骤3次，最后用石蜡切片机将组织芯片表面修平。
[0012]步骤二中采用的两个双色探针为EGFR/CEP7探针和CCND1/CEP11探针，单色探针为MYC探针。
[0013]步骤二中切片预处理的步骤为:将制作好的组织芯片切片，将切好的白片置于560C烤箱过夜;次日室温二甲苯中脱蜡1min X 2次，依次无水乙醇5 min，梯度乙醇100%、85%、70%各3min，蒸馏水5min浸洗;高压修复2min，胃酶工作液37 °C消化9_15min ；室温2 X SSC溶液5min，1%多聚甲醛/I XPBS 1min，2 X SSC溶液5min，梯度乙醇75%、85%、100%各3min浸洗，自然晾干玻片。
[0014]步骤二中变性杂交滴加的探针量为lOyL，在杂交仪中变性83°C，8min，杂交42°C，16h0
[0015]步骤二中洗涤复染步骤为:避光下取出玻片，揭去封胶，室温浸于2XSSC液中使盖玻片自然脱落，依次 37°C 50% 甲酰胺/2XSSC 15min，2XSSC 15min，0.1%ΝΡ_40/2 X SSC5min，梯度乙醇75%、85%、100%各3min浸洗。自然晾干玻片，滴加DAPI封片，放置15min后于荧光显微镜下观察并拍照。
[0016]步骤三中每个点计数100个轮廓清晰、与周围细胞没有重叠、荧光信号清晰的细胞。
[0017]本发明解决技术问题的效果:
1.将同一组不同部位的组织样本固化在同一张组织芯片上，一张芯片可同时承载15-20组标本，然后可对这张组织芯片进行免疫组化、免疫荧光、荧光原位杂交等多种检测。由此，我们能够实现对多组组织标本、同一组不同部位的组织标本同时进行高通量的检测，不仅减少能有效地降低实验成本，节省时间、人力，也可减少由于分次实验造成的误差，提高实验结果的一致性，实现较好的质量控制。
[0018]2.首次采用多探针联合荧光原位杂交技术评估三阴性乳腺癌瘤内异质性，相对于以往瘤内异质性检测方法，降低了对昂贵设备的依赖性和投资成本，易于大范围推广。
[0019]3.首次利用多探针联合荧光原位杂交法对三阴性乳腺癌瘤内异质性进行定量检测，提出了确定的数值范围，为三阴性乳腺癌瘤复发和转移风险提供明确的评估指标。
【附图说明】
[0020]图1是本发明组织芯片的结构示意图。图中中部的多个圆点为组织芯孔。
【具体实施方式】
[0021]本发明的一种用于检测三阴性乳腺癌瘤内异质性的方法，其特征是:包括以下步骤:
一、三阴性乳腺癌瘤内异质性检测芯片的制作:
1.制作受体蜡块:
(I)在石蜡包埋机下，用铅制模具制成25.0mm X 23.8mm X 5.0mm芯片所用的受体蜡块。
[0022](2)采用直径为1.0mm组织取样针在受体蜡块上打孔，深度约为0.4cm，每两个相邻组织芯的间距约2.0mm，制备成8行X 8列的微阵列。
[0023]2.供体蜡块取材:
(I)收集所需检测的16名三阴性乳腺癌患者的癌组织及配对正常组织石蜡标本作为供体蜡块。供体蜡块来源于常规存档蜡块。
[0024](2)供体蜡块制切片后进行H&E染色，由病理科医师在显微镜下观察组织结构典型的乳腺癌区，并在玻片上圈出。对照H&E染色切片，在供体蜡块相应部位上作好标记。
[0025](3)在组织芯片制作仪上用同一直径的取样针对供体蜡块标记部位进行取样。
[0026]3.瘤内异质性组织芯片制作:
(I)将供体蜡块上取得的组织芯垂直塞入受体蜡块对应位置的空白孔芯中。每位患者取一个正常对照组织(a)和三个不同位置的癌组织化、(:、(1)。&、13、(3、(1在受体蜡块上从左到右依次相