一种抗pd-l1单克隆抗体的生物活性测定方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物药物活性检测领域，特别涉及一种抗ro-Li单克隆抗体的生物活 性测定方法。
【背景技术】
[0002] ro-1/PD-Li信号通路与肿瘤和病毒的免疫逃逸密切相关，是免疫治疗肿瘤和慢性 传染病的重要新靶点。利用抗ro-l、PD-Ll的单克隆抗体阻断ro-1/PD-Ll信号通路，恢复T细 胞的免疫杀伤功能，能够发挥良好的治疗效果，具有很好的应用前景。
[0003] PD-1是一种免疫共抑制分子，属于⑶28家族成员，由268个氨基酸组成的I型跨膜 蛋白，定位于rocDi基因上，它的结构主要包括胞外免疫球蛋白可变区（igv)样结构域、疏水 的跨膜区以及胞内区。胞内区包括C端和N端氨基酸残基，含有2个独立的磷酸化作用位点， 分别为免疫受体酪氨酸抑制基序（immunoreceptor tyrosine based inhibitorymotif， ITIM)和免疫受体酪氨酸转换基序（immunoreceptor tyrosine based switch motif， ITSMhro-1主要表达在T细胞、B细胞、NK细胞及多种肿瘤细胞的膜表面。PD-1有2个配体，即 PD-L1和TO-L2，是属于B7家族的跨膜分子，基因都定位于人染色体9p24.21D-L1是由290个 氨基酸亚基组成的跨膜蛋白，胞外段为两个免疫球蛋白恒定区（IgC)和IgV样结构域，主要 表达于成熟的CD4+T细胞、CD8+T细胞、单核细胞、巨噬细胞、B细胞、树突状细胞等造血细胞， 以及一些非造血细胞，如内皮细胞、胰岛细胞、肥大细胞等的膜表面，而且在多种肿瘤细胞 均高表达PD-L1分子。PD-L2是由274个氨基酸残基组成的跨膜蛋白，与PD-L1有很高的相似 性，但两者也具有一定的差异，如TO-L2的体内组织分布具有局限性，只在巨噬细胞、树突状 细胞和一些B细胞亚类的膜表面表达。
[0004] PD-1/PD-L1信号通路在T细胞免疫过程中，起到重要作用。T细胞在静息状态下低 表达H)-l，而激活则引起PD-1的表达上调。PD-1作为一种抑制共受体，与PD-L1相互作用后 能够抑制T细胞的活性，使细胞阻滞在G0/G1期，从而抑制T细胞的增殖，阻碍其分化为浆细 胞，并诱导T细胞的凋亡。这样就避免了 T细胞的无限增殖，使其维持动态平衡。这种PD-1/ PD-L1信号通路参与的T细胞负反馈调节作用对抗原的清除以及对维持机体的平衡起到至 关重要的作用。
[0005] ro-1/PD-Ll信号通路与肿瘤也有密切的关系。在肿瘤患者体内，PD-L1的高表达能 够增强肿瘤的转移能力、导致患者死亡率上升。研究发现，多种肿瘤细胞高表达H)-L1，如黑 素瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、肾细胞癌等。肿瘤细胞在多种细胞因子的作用下高表达PD-L1，这一现象与肿瘤的免疫逃逸相关，但是在离体环境中，肿瘤细胞的H)-L1表达相对较低， 表明ro-Ll的表达与其所处的微环境密切相关。此外，肿瘤部位浸润性CD8+T细胞也受到肿 瘤微环境的影响，ro-1的表达比外周血中的T细胞要高。当PD-1与肿瘤细胞表面的PD-L1作 用，抑制T细胞的活化与增殖，使得T细胞丧失对肿瘤细胞的杀伤作用，故而引起免疫逃逸。 因此，有针对性地阻断ro-1/PD-Ll信号通路，能够增强T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。
[0006] 由此可见，提供一种方法来检测抗ro-i、PD_L1单克隆抗体的生物活性是必要的。 生产抗ro-Li单克隆抗体，对其生物活性的检测则是一项必不可少的工作。近几年报告基因 法发展迅速，尤其在生物学领域的运用上，是其他检测方法不能比拟的。萤火虫荧光素酶在 报告基因法上的使用，更是拓宽了其在生物学领域上的运用。萤火虫荧光素酶是一类能够 催化不同底物发生氧化作用并伴随发出生物荧光的酶，其检测速度快，灵敏度高、稳定性 好、线性范围广等优点，具有其他报告基因无可替代的优势。
[0007] 利用荧光素酶报告基因法所构建的细胞筛选模型，建立抗PD-L1单克隆抗体生物 活性测定方法，从而对其进行评价和筛选，可作为此类药物早期研发与筛选过程中的一种 有效措施。
【发明内容】
[0008] 有鉴于此，本发明提供一种抗ro-Li单克隆抗体的生物活性测定方法。该方法基于 荧光素酶报告基因法，通过因素考察与优化，建立了一种抗ro-Li单克隆抗体生物活性测定 方法，可用于抗ro-Li单克隆抗体的快速评价与筛选。
[0009] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0010] 本发明提供了 PD1细胞和PD-L1细胞在检测抗PD-L1单克隆抗体的生物活性中的应 用。
[0011 ]本法利用roi/ro-Li阻断检测系统，本检测系统的工具细胞株为转染细胞株，即分 另|J转染荧光素酶基因 luc和PD-L1基因，作为抗PD-L1单克隆抗体生物学活性检测的靶细胞 和效应细胞。当抗PD-L1单克隆抗体与靶细胞表达的PD-L1结合，阻断了 PD1与H)-L1蛋白的 结合，通过信号转导激活了转录因子NFAT，启动荧光素酶的表达，其表达量与抗PD-L1单克 隆抗体的生物活性呈正相关，加入细胞裂解液和荧光素酶底物后，测定其化学发光值并绘 制量效曲线，以此测定抗PD-L1单克隆抗体生物学活性。此法操作简单，专属性强，耐用性 高，对于抗H)-L1单克隆抗体的质量控制和临床应用具有重要意义。
[0012] 在本发明的一些具体实施方案中，PD1细胞可以为CS187102-GloResponseTM NFAT-luc2/PDl Jurkat Cell Line(PDl cell)，PD-L1 细胞可以为CS187108-PD-1 Bioassay，F*D-L1+CH0K1 (F*D-L1 cell)。两种工具细胞购于Promega公司。
[0013]本发明还提供了一种抗ro-Li单克隆抗体的生物活性的测定方法，取PD1细胞和 PD-L1细胞与待测样品混合后孵育，通过荧光素酶报告基因法测定抗ro-Ll单克隆抗体的生 物活性;所述待测样品为抗ro-Li单克隆抗体。
[0014]在本发明的一些具体实施方案中，所述PD-L1细胞的接种密度为3 X 105~5 X 105 个/mL。
[0015]在本发明的一些具体实施方案中，所述PD1细胞的接种密度为1 X 106~4X 106个/ mL〇
[0016]在本发明的一些具体实施方案中，所述待测样品的浓度为Og/mL~2.5Xl(T5g/mL。 [0017]在本发明的一些具体实施方案中，PD1细胞和PD-L1细胞与待测样品于37°C、5% C〇2培养箱中培养6~8小时。
[0018]在本发明的一些具体实施方案中，所述荧光素酶报告基因法为取发光底物与孵育 后的PD1细胞和PD-L1细胞与待测样品的体系混合，平衡后测定荧光强度，获得所述待测样 品的EC5q值。
[0019] 在本发明的一些具体实施方案中，所述平衡的温度为15°C~25°C，所述平衡的时 间为5~20min。
[0020] 在本发明的一些具体实施方案中，所述ro-Li细胞的制备方法包括如下步骤：
[0021 ]步骤1:取出冻存的ro-Ll细胞，将细胞快速融化复苏后，转入含有细胞生长培养基 的培养瓶中，于37 °C、5 % C02培养箱中培养；
[0022] 步骤2: PD-L1细胞接种及培养:取处于对数生长期的PD-L1细胞，加 0.25%胰蛋白 酶(gibco 25200-056)lmL消化3~5min、230xg，离心5min，将细胞稀释至3X105~5X105个/ mL；
[0023]所述roi细胞的制备方法包括如下步骤：
[0024]步骤a:取出冻存的H)1细胞，将细胞快速融化复苏后，转入含有细胞生长培养基的 培养瓶中，于37 °C、5 % C02培养箱中培养；
[0025] 步骤b:H)l细胞的培养:取处于对数生长期的H)1细胞，170xg，离心5min，将细胞稀 释至 1 X 106 ~4 X 106 个/mL;
[0026] 所述待测样品的制备方法为:配制待测样品溶液，通过BCA法测定其浓度，以含有 2 % FBS的RPMI 1640培养基对待测样品按倍比依次稀释，稀释梯度为10~11个;待测样品的 浓度范围为Og/mL~2.5X 10-5g/mL。
[0027] 在本发明的一些具体实施方案中，所述测定方法包括如下步骤：
[0028] 步骤1:取所述PD-L1细胞接种于96孔板，接种密度为每孔3X104~5X104个，于37 °C、5%C02培养箱中培养;将最大浓度为2.5 X l(T5g/mL，2.5倍稀释的待测样品和1 X 106~4 X 106个/mL的H)1细胞，以每孔40yL加至96孔板中，每个待测样品的浓度设置3个平行复孔， 于37°C、5%C〇2培养箱中培养6