一种无光学干扰的拉曼标记探针及其制备方法和应用
【专利摘要】本发明以对巯基苯乙炔为主体结构设计了一系列拉曼散射峰位在1800?2400 cm?1波数区信号分子，选择金、银纳米粒子作为拉曼信号的增强基底，将带巯基的炔烃信号分子自组装于增强基底表面并使用巯基乙酸对SERS信号进行优化，然后选择透光、亲水并富含活性反应基团的包裹材料进行探针封装，最后在包裹材料外层嫁接特定的生物靶向功能分子。此探针拉曼散射的光学响应强、窄带单峰发射、无光学背景干扰，在多组分同时标记的生物成像领域意义重大。该技术可延伸至以带通滤光片为分光器件，以光电倍增管（PMT）或雪崩光电二极管（APD）为检测器件的无光栅超快拉曼成像仪的设计与开发，克服了拉曼成像逐点扫描、成像慢的技术瓶颈，将填补光学成像类仪器的市场空白。
【专利说明】
-种无光学干扰的拉曼标巧探针及其制备方法和应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物成像技术领域，设及一种新型烘控编码、生物祀向的表面增强拉 曼散射（Surface-enhanced Raman scattering,沈RS)活性纳米标记探针的制备方法。更重 要的是，设及W带通滤光片为分光器件，W光电倍增管(PMT)或雪崩光电二极管(APD)为检 测器件的无光栅超快拉曼成像仪的设计与开发。
【背景技术】
[0002] 生物成像(如活细胞成像)技术使得科学家可W实时和动态观察生物体内部结构 和生理过程，彻底革新了生物学家研究生物体活动机制的方式。在众多的生物成像技术中， 巧光标记成像应用最为广泛和成熟。它利用可吸收特定波长的光并发射出波长更长的光 (巧光）的信号探针，比如小分子有机染料或者巧光蛋白来特异性地标记生物体系中的特定 组分，并通过其巧光信号的定位来获取目标生物物质的分布情况，极大地提升了人们探索 生物体内部结构和过程的能力。然而，运种成像技术明显受制于巧光光谱法的固有缺陷，即 传统的巧光染料发射峰宽（约50nm)过宽会造成多色(或多组分)标记时信号重叠而难W区 分、辨析。量子点技术近年来的进展克服了上述传统有机巧光染料和巧光蛋白的固有缺陷， 其发射峰窄且对称，相互重叠小W及其发射峰波长可由其组成材料和粒径进行精细调节等 优良特性倍受细胞标记和成像研究的青睐，但其潜在的生物毒性使其应用于活体成像的一 些深入研究难有新的进展。
[0003] 表面增强拉曼散射（Surface-enhanced Raman scattering,S邸S)技术除具有非 破坏性、高光谱特异性和不受水干扰等普通拉曼光谱的优点外，还具有更低的检测限和更 高的灵敏度(具备单分子检测的能力），特别是在纳米技术强势介入生物医学领域的情形 下，各种具有表面增强拉曼散射效应的金(银)纳米颗粒广泛应用于生物样品的分析检测与 生物成像研究。为了提高拉曼检测的灵敏度，人们对SERS基底材料的选择和制备进行了大 量的研究。然而，作为另一个决定探针优劣的重要因素，信号分子的选择和设计却并未引起 人们足够的重视。新颖的信号分子的提出通常需要经过合理的设计，仔细的筛选和系统的 表征，相较于选择"现成"的SERS探针而言则无疑显得过于繁琐，从而造成了现如今关于信 号分子设计的工作少之又少。但是在复杂的研究体系当中，SERS探针分子的随意选用却可 能会成为研究进一步发展的障碍，因为干扰分子或检测分子与传统的SERS信号分子极易发 生光谱重叠的现象，运将会严重影响结果的精确性。随着多目标同时检测概念的提出，运一 困扰甚至会延伸至各类SERS探针分子之间，运时传统信号分子选择的困难性将会进一步被 放大。面对如此困境，人们迫切需要大量相互无重叠的新颖信号分子用于复杂体系的抗干 扰、多目标分析检测。
[0004] 烘基的拉曼特征峰在2120cnfi附近，在运一光谱区域细胞内常见的干扰物质是没 有拉曼响应的，所W近些年在不少研究中人们将烘控标记的生物代谢分子，如DNA、RNA、蛋 白质、脂类等用于生物标记成像并取得了不错的效果;此外，烘基的拉曼位移和强度会因为 与之相连的取代基的不同而发生明显偏移，甚至仅仅是将烘基的碳原子1化更换为它的同位 素 i3c，拉曼位移就会产生100个波数的偏移，运两点预示了烘控的衍生物极其适合抗干扰的 多目标分析检测。但是，烘控类信号分子的广泛应用却依然被自发拉曼散射信号强度很弱 的问题严重限制，为了检测到极度微弱的烘基拉曼散射信号，人们不得不提高曝光时间或 使用高强度激光，由此却又可能引起样品的损伤；近些年也有人尝试使用受激拉曼散射 (stimulated Raman scattering, SRS)技术进行相关研究，但昂贵的仪器价格让人们望而 生畏的同时，其在多目标同时成像上的捉襟见肘也使其无法成为生物成像领域的通用仪 器。结合近些年研究较多的SERS技术，它提供106~1〇12倍的信号增强，理论上将是一个改善 烘基自发拉曼散射信号较弱的理想途径。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种新型烘控编码、生物祀向的表面增强拉曼散射 (Surface-enhanced Raman scattering,SERS)活性纳米标记探针的制备方法，更重要的 是，发展一种亮度高、多色输出、光学稳定且无干扰的新型SERS成像技术。该技术(包括探针 产品）可在常规的商品化共聚焦拉曼谱仪上实现广泛的生物成像应用；同时，亦能用于W带 通滤光片为分光器件，W光电倍增管(PMT)或雪崩光电二极管(APD)为检测器件的无光栅超 快拉曼成像仪的设计与开发。
[0006] 本发明提供的技术方案如下：
[0007] -种无光学干扰的拉曼标记探针的制备方法，包括W下步骤:将拉曼散射峰位在 1800-2400cnfi波数区、带宽为1 -2nm的窄带单峰信号分子通过Au-S键或Ag-S键自组装到增 强基底的表面，然后采用透光亲水的壳体材料进行探针封装，即得到无光学干扰的拉曼标 记探针；
[0008] 所述的窄带单峰拉曼信号分子，具有通式I所示的结构：
[0009]
[0010]
[0011] 其中，Ri、R2、R3、R4为-N化、-C曲或Η，Rs为Η或-Si (C出）3、-C2也、-C此C此C出細、苯基或 烘基；
[0012] 所述的增强基底为粒径30-60nm的纳米粒子，所述的纳米粒子为（i)纳米金、（ii) 纳米银或（i i i) W纳米金或纳米银为壳的核壳结构纳米粒子；
[0013] 所述的壳体材料为生物分子、聚合物、二氧化娃中的一种。
[0014] 进一步地，Rs为Η的窄带单峰信号分子自组装到增强基底的表面后，用琉基簇酸对 窄带单峰信号分子与增强基底的连接方式进行优化，接着采用透光亲水的壳体材料进行探 针封装。
[0015] 再进一步地，将探针封装后在壳体材料上嫁接生物祀向分子。
[0016] 所述的窄带单峰拉曼信号分子为
[0017]
[001 引
[0019] 所述的琉基簇酸为琉基乙酸、琉基丙酸、琉基下酸中的一种或几种;所述的生物祀 向分子为抗体、配体、多肤中的一种。
[0020] 所述的抗体为促黄体激素释放激素，所述的配体为叶酸，所述的多肤为细胞穿透 肤或核定位肤。
[0021] 所述的生物祀向分子通过与邸C-N服或戊二醒交联反应嫁接到探针表面。
[0022] -种无光学干扰的拉曼标记探针，由所述的无光学干扰的拉曼标记探针的制备方 法制备得到。
[0023] 所述的无光学干扰的拉曼标记探针在生物成像中的应用。
[0024] -种高灵敏超快拉曼成像仪，W所述的无光学干扰的拉曼标记探针为检测对象， 在常规的光学显微镜基础上，W激光作为激发光源，配置高精度的快速扫描样品台，W超窄 带带通滤光片提取探针的窄带单峰超强拉曼散射信号，W超灵敏的雪崩光电二极管为检测 元件，通过样品台的二维扫描逐点采集探针的光子信号并作伪彩色处理。
[0025] 此快速、灵敏和高空间分辨拉曼成像仪器W带通滤光片的波长标定色差，W光子 信号的强度标定色度。
[0026] 将所述的无光学干扰的拉曼标记探针对多个祀标进行标记，使用带二维自动扫描 平台的拉曼光谱仪，快速地逐点采集光谱，进而对探针窄带单峰的超强拉曼散射信号作伪 彩色图像处理，其散射峰的位移用于标定色差，散射峰的强度用于标定色度;所述快速采集 光谱的条件为:曝光时间为Is,波长范围为ASOcnfi;所述的祀标为细胞、组织或生物体。
[0027] 本发明的原理为：
[0028] 1. W对琉基苯乙烘为主体结构，通过替换烘基末端取代基团来改变烘基拉曼散射 信号的位移，可根据密度泛函理论计算对烘控类信号分子的结构-拉曼位移的关系进行一 系列预测及理论研究，筛选出不同窄带单峰的分子结构。
[0029] 2.合成不同形状、尺寸的金、银及其核壳结构纳米粒子，筛选出高增强活性的纳米 粒子作为SERS增强基底，将烘控信号分子通过Au-S或Ag-S键自组装单层于增强基底表面。
[0030] 3.信号分子的自组装过程中可使用琉基乙酸等对信号分子与增强基底的连接方 式进行优化，W消除由于空间取向不同导致的干扰峰，保证在1800~2400cnfi光谱区间内的 窄带单峰输出模式。
[0031] 4. W生物大分子、聚合物或二氧化娃料作为保护壳层，封装自组装有信号分子贵 金属纳米粒子等探针母体，其外表面提供富含反应活性基团利于后续生物功能分子的嫁 接。
[0032] 5. W配体(如叶酸）、抗体(如促黄体激素释放激素）、多肤类(如细胞穿透肤、核定 位肤等)等生物功能分子通过抓C-NHS或戊二醒等交联反应至探针表面，即可得具有特异生 物祀向功能的SERS成像探针。
[0033] 相对于现有SERS成像探针，本发明具有W下优点和有益效果：
[0034] 1.该探针在1800-2400cnfi光谱区发射窄带（l-2nm)单峰的超强拉曼散射信号，能 够有效避免细胞内源物质在低波数区域(<1800cnfi)的本征拉曼信号和巧光信号的干扰;该 探针所使用信号分子的烘基拉曼位移可W通过改变对琉基苯乙烘主体结构中烘基末端的 取代基团来调节，在多色成像应用中能有效避免标记信号之间互相重叠的问题;该探针信 号强度大、光学稳定，使用常规拉曼光谱仪能有效缩短生物成像时间，其窄带单峰的输出模 式可用于无光栅超快拉曼成像仪的设计与开发。
[0035] 2.该探针拉曼散射的光学响应强、窄带单峰发射、无光学背景干扰，在多组分同时 标记的生物成像领域意义重大。该技术可延伸至W带通滤光片为分光器件，W光电倍增管 (PMT)或雪崩光电二极管(APD)为检测器件的无光栅超快拉曼成像仪的设计与开发，克服了 拉曼成像逐点扫描、成像慢的技术瓶颈，将填补光学成像类仪器的市场空白。
【附图说明】
[0036] 图1为琉基乙酸对信号分子与增强基底的连接方式进行改善的原理示意图。
[0037] 图2为Β1、Β2、Β3Ξ种信号分子的拉曼位移光谱对比图。
[0038] 图3为琉基乙酸对信号分子与增强基底的连接方式进行改善的光谱强度对比图。
[0039] 图4为Β3信号分子制备的SERS探针与花粉细胞内源物质在不同波数处的细胞成像 对比图；其中，图4(A)为1580cm-i的细胞成像图，图4(B)为2212cm-i的细胞成像图。
[0040]图5为Β1、Β2、Β3Ξ种信号分子制备的SERS探针的贴壁细胞成像图。
[0041 ] 图6为B1、Β2、Β3Ξ种SERS探针在同一细胞中的光谱图。
[0042] 图7为Β1、Β2、Β3Ξ种SERS探针在同一细胞中的细胞成像图。
【具体实施方式】
[0043] 下面结合实例对本发明作进一步详细的描述，并W实例证明本方法的优势，但本 方法的实施方式不限于此。
[0044] 实施例1:窄带单峰拉曼信号分子的制备
[0045] 烘控类窄带单峰拉曼信号分子设计:本发明W对琉基苯乙烘为主体结构，通过替 换烘基末端取代基团来改变烘基拉曼散射信号的位移，并利用密度泛函理论计算对信号分 子的结构-拉曼位移的关系进行一系列预测及理论研究，得到了下表中的化学结构及其拉 曼位移，证明了当在对琉基苯乙烘的烘基末端改变基团时能有效的调节窄带单峰信号分子 拉曼信号的位移。
[0046]
[0047] 信号分子光谱优化：W-定尺寸的银包金纳米粒子为增强基底，使用532nm对对琉 基苯乙烘分子的拉曼光谱进行优化，发现当金纳米粒子加入对琉基苯乙烘时，会在1972畑1一1 和2105cnfi处分别产生一个拉曼信号，经过密度泛函理论计算证实运是由于信号分子与增 强基底的空间取向不同导致的，经过研究发现加入琉基乙酸时能够对信号分子与增强基底 的连接方式进行改善，结果示意图如图1所示。
[0048] 信号分子SERS光谱:根据信号分子光谱优化结果，选择Ξ种窄带单峰信号分子B1、 B2、B3为例，得到的实际SERS光谱如图2所示，Ξ者的烘基拉曼位移分别位于2105cm-i、 2158cnfi、2212cnf 1处，能有效地避免相互之间的干扰。
[0049] 实施例2
[0050] (1 )AuNPs-标记分子：取lOmL银包金纳米溶胶Ξ份，分别向其中加入10化浓度为 ImM的窄带单峰信号分子B1、B2、B3的四氨巧喃溶液。
[0051] (2)琉基乙酸优化:上述溶液静置化后加入10化L浓度为lOmmol/L的琉基乙酸的水 溶液。（此步骤仅在信号分子的烘基末端没有取代时需要，譬如WB1为信号分子）。
[0052] (3)保护壳层:再静置化后继续加入ImL浓度为O.lwt%。的多环芳控(PAH)水溶液。
[0化3] (4)生物功能分子连接：1化后同时加入10化浓度为lOmM的1-(3-二甲氨基丙基)- 3-乙基碳二亚胺盐酸盐化DC · HC1)水溶液和20化浓度为ImM的N-径基班巧酷亚胺(NHS)水 溶液，静置活化簇基，化后分别向Ξ份溶液中加入20化浓度为ImM的叶酸(FA)、促黄体激素 释放激素(LH畑)、细胞穿透肤(CALNNR8)溶液。
[0054] (5)静置一夜后离屯、收集并重悬至粒子浓度约为1〇12个/mL，放入冰箱中保存备用。 其中FA和LH畑修饰的SERS探针具有细胞膜祀向能力，CALNNR8修饰的SERS探针具有内质网 祀向能力。
[00对 WB1为信号分子，使用不同量的琉基乙酸进行优化:取立份101^的Bl-AuNPs纳米 粒子，向其中分别加入0、1、10、100化浓度为1 Ommo 1 /L的琉基乙酸的水溶液，静置Ξ小时后 测得的SERS光谱，如图3所示。
[0056] 实施例3
[0057] 取lOmL粒子浓度约为10"个/mL的银包金纳米溶胶，向其中加入20化浓度为ImM的 B3信号分子，静置化后继续加入ImL浓度为O.lwt%。的多环芳控(PAH)水溶液，继续静置12h 后制得SERS探针。
[0058] 取lOmL均匀分散有百合花粉的水溶液，并向其中加入ImLSERS探针，在摇床上混匀 后将花粉溶液冻干W除去水分。
[0059] 配制高浓度的薦糖溶液并滴加少量至载玻片上，惊干后表层形成均匀透明的薦糖 层。取少量花粉颗粒洒落在薦糖层上并轻轻吹气W施加压力，使花粉牢固地粘附在薦糖表 面后可进行拉曼成像实验。
[0060] W花粉中的类黄酬类物质在1580cnfi的拉曼信号为干扰峰进行验证实验。可W发 现，烘基信号分子在1580cnfi低波数区域的拉曼信号很容易与花粉中的干扰峰发生光谱重 叠现象(见图4(A))，运对最终结果会产生极大干扰，而使用2212cnfi的标记峰则能有效避免 此类问题(见图4(B))。证实了烘基SERS探针在细胞成像研究中对细胞内源物质的抗干扰能 力。
[0061 ] 实施例4
[0062] 取10血粒子浓度约为1〇12个/mL的银包金纳米溶胶Ξ份，分别向其中加入20化浓度 为ImM的窄带单峰信号分子B1、B2、B3的四氨巧喃溶液。静置化后继续加入ImL浓度为 0.1 wt%。的琉基聚乙二醇化S-PEG)水溶液，静置化后即可制得相应的SERS探针。
[0063] 在一次性培养皿(35mm)中放入直径为20mm的玻璃盖玻片(均经过高溫消毒），取细 胞传代的最后一步稀释后分散均匀的细胞悬浮液(300~50化L)均匀滴加至盖玻片表面。在 培养箱中静置2-4h后，细胞基本贴壁，补加2.5mL新鲜细胞培养液，等待4h。
[0064] 取Ξ份上述方法准备的贴壁细胞，并向其中分别加入Ξ种SERS探针，在培养箱中 继续共培养12h后取出，使用PBS缓冲溶液轻轻冲洗盖玻片，清除吸附于细胞膜表面而未进 入细胞中的SERS探针，之后可进行成像实验。
[0065] 如图5所示，Ξ种SERS探针均在细胞内呈现出了良好的分布状况，并且各个通道之 间完全无影响，证明了 Ξ种烘控SERS探针相互之间不会发生干扰。
[0066] 实施例5
[0067] 取10血粒子浓度约为1〇12个/mL的银包金纳米溶胶Ξ份，分别向其中加入20化浓度 为ImM的窄带单峰信号分子B1、B2、B3的四氨巧喃溶液。静置化后继续加入ImL浓度为 O.lwt%。的聚丙締胺水溶液。1化后同时加入10化浓度为lOmM的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙 基碳二亚胺盐酸盐化DC ·肥1)水溶液和20化浓度为ImM的N-径基班巧酷亚胺(NHS)水溶液。 静置活化簇基Ih后分别向Ξ份探针中加入20化浓度为ImM的叶酸(FA)、促黄体激素释放激 素（LHRH)、细胞穿透肤（CALNNR8)溶液。静置一夜后离屯、收集即可制得Ξ种相应的SERS探 针。
[006引在一次性培养皿(35mm)中放入直径为20mm的玻璃盖玻片(均经过高溫消毒），取细 胞传代最后一步稀释后分散均匀的细胞悬浮液(300~5(Κ)μυ均匀滴加至盖玻片表面。在培 养箱中静置2-4h后，细胞基本贴壁，补加2.5mL新鲜细胞培养液，等待4h。
[0069] 细胞完全贴壁后加入具有内质网祀向能力的SERS探针(B3-CLANNR8-NPS) 200化并 轻轻混匀。在培养箱中继续共培养12h后取出，使用PBS缓冲溶液轻轻冲洗盖玻片，清除吸附 于细胞膜表面而未进入细胞中的内质网祀向探针，然后补加3mL新鲜培养基至小培养皿中， 并加入两种细胞膜祀向SERS探针(Bl-FA-NPs和OPEl-LHRH-NPs)各200yL。继续培养2-4h后 可进行SERS成像研究。
[0070] 图6是在细胞中测得的较为典型的SERS光谱，可W发现Ξ种标记分子的信号能够 非常清楚地区分开，并且完全不会被细胞内源物质所干扰。图7是Ξ种探针在同一细胞中经 过检测实际得到的成像结果，Ξ种SERS探针均按照生物功能分子的作用实现了特异性祀向 结果。
【主权项】
1. 一种无光学干扰的拉曼标记探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤:将拉曼散 射峰位在1800-24000^ 1波数区、带宽为l-2nm的窄带单峰信号分子通过Au-s键或Ag-s键自 组装到增强基底的表面，然后采用透光亲水的壳体材料进行探针封装，即得到无光学干扰 的拉曼标记探针； 所述的窄带单峰拉曼信号分子，具有通式I所示的结构：其中，Ri、R2、R3、R4为-N〇2、-CH3 或Η，1?5为!1 或-S i (CH3) 3、-C2H5、-CH2CH2CH 2OH、苯基或炔基； 所述的增强基底为粒径30_60nm的纳米粒子，所述的纳米粒子为（i)纳米金、（ii)纳米 银或（i i i)以纳米金或纳米银为壳的核壳结构纳米粒子； 所述的壳体材料为生物分子、聚合物、二氧化硅中的一种。2. 根据权利要求1所述的无光学干扰的拉曼标记探针的制备方法，其特征在于:抱为!1的 窄带单峰信号分子自组装到增强基底的表面后，用巯基羧酸对窄带单峰信号分子与增强基 底的连接方式进行优化，接着采用透光亲水的壳体材料进行探针封装。3. 根据权利要求1或2所述的无光学干扰的拉曼标记探针的制备方法，其特征在于:将 探针封装后在壳体材料上嫁接生物靶向分子。4. 根据权利要求3所述的无光学干扰的拉曼标记探针的制备方法，其特征在于:所述的 窄带单峰拉曼信号分子为5. 根据权利要求3所述的无光学干扰的拉曼标记探针的制备方法，其特征在于:所述的 巯基羧酸为巯基乙酸、巯基丙酸、巯基丁酸中的一种或几种;所述的生物靶向分子为抗体、 配体、多肽中的一种。6. 根据权利要求5所述的无光学干扰的拉曼标记探针的制备方法，其特征在于:所述的 抗体为促黄体激素释放激素，所述的配体为叶酸，所述的多肽为细胞穿透肽或核定位肽。7. 根据权利要求5所述的无光学干扰的拉曼标记探针的制备方法，其特征在于:所述的 生物靶向分子通过与H)C-NHS或戊二醛交联反应嫁接到探针表面。8. -种无光学干扰的拉曼标记探针，其特征在于：由权利要求1-7任一项所述的无光学 干扰的拉曼标记探针的制备方法制备得到。9. 权利要求8所述的无光学干扰的拉曼标记探针在生物成像中的应用。10. -种高灵敏超快拉曼成像仪，其特征在于：以权利要求8所述的无光学干扰的拉曼 标记探针为检测对象，在常规的光学显微镜基础上，以激光作为激发光源，配置高精度的快 速扫描样品台，以超窄带带通滤光片提取探针的窄带单峰超强拉曼散射信号，以超灵敏的 雪崩光电二极管为检测元件，通过样品台的二维扫描逐点采集探针的光子信号并作伪彩色 处理。
【文档编号】G01N21/65GK105823770SQ201610351941
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年5月25日
【发明人】沈爱国, 陈勇, 任家强, 胡继明
【申请人】武汉大学