一种利用高粱花叶病毒p3n-pipo构建的亚细胞定位试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种利用高粱花叶病毒P3N?PIPO构建的植物亚细胞定位试剂盒，包括4个分别标记绿色、红色、黄色和青色荧光蛋白的胞间连丝定位载体：SrMV?P3N?PIPO?GFP、pSrMV?P3N?PIPO?RFP、pSrMV?P3N?PIPO?YFP和pSrMV?P3N?PIPO?CFP；4个无特异亚细胞定位的对照载体：pSAT6?EGFP?C1、pSAT6?ERFP?C1、pSAT6?EYFP?C1和pSAT6?ECFP?C1；限制性内切酶Xho I、Hind III、无RNase水和侵染液。使用本试剂盒可以快速明确目的基因表达产物是否具有胞间连丝定位的特性。
【专利说明】
-种利用高梁花叶病毒P3N-PIPO构建的亚细胞定位试剂盒
技术领域 [0001] 本发明设及一种试剂盒，具体设及一种利用高梁花叶病毒P3N-PIP0构 建的亚细胞定位试剂盒。本发明利用分别带有绿色巧光蛋白（green fluorescent protein,GFP)标记、红色巧光蛋白（red fluorescent protein,RFP)、黄色巧光蛋白 (yellow fluorescent protein,YFP)和青色巧光蛋白（cyan fluorescent protein,CFP) 的具有特异胞间连丝(Plasmodesma,PD)定位功能的蛋白SrMV-P3N-PIP0,指示待验证基因 表达蛋白是否具有胞间连丝定位的特性，属于生物。
【背景技术】 [0002] 随着生物技术的发展，尤其是基因组学的发展和测序技术的进步，越 来越多的新基因被发现，已经形成了海量数据。明确未知基因的功能，探讨其潜在的应用价 值，是基因组学研究的终极目标。蛋白质是基因的表达产物，蛋白质的亚细胞定位与蛋白质 的结构和功能关系密切，蛋白质必须处于合适的位置才能发挥其功能。对于一个新基因，明 确其表达产物即蛋白质的亚细胞定位，可W为研究该基因的功能提供重要线索。目前，确定 蛋白质亚细胞定位的方法主要有Ξ种:细胞分馈法，电子显微镜分析，激光共聚焦法，其中 激光共聚焦法应用最为广泛。激光共聚焦法利用标记巧光蛋白受激发产生的巧光信号，可 W直观的观察到目标蛋白所在的亚细胞位置。在对目标蛋白的亚细胞定位进行研究时，需 要阳性对照，即具有特异亚细胞地位的带有可检测标记的蛋白，佐证未知蛋白的定位。
[0003] 胞间连丝(Plasmodesma，PD)是植物体内穿过细胞壁连接相邻细胞的细胞质和内 质网的连丝微管，是细胞间物质运输与信息传递的重要通道。PD的结构极其复杂，至今依然 没有完全清楚，其结构模型一直处于补充更新状态。ro的通透性受多种因素调节，小分子物 质可W通过胞间连丝自由扩散，但是蛋白质、核酸等大分子或者大分子复合体如病毒粒子、 核糖体蛋白复合体等的胞间移动受PD的调控。对于植物胞间信号传导和物质运输等方面的 研究而言，尽管可W利用生物信息学手段对分离到的基因的编码蛋白亚细胞定位进行预 巧。，但是必须对该基因编码蛋白做亚细胞定位进行生物学实验，明确其能否定位于PD，进而 判定该蛋白是否参与胞间信号转导和物质运输，为研究其功能提供直观的实验证据。
[0004] 2008年，Chung等利用生物信息学方法，对包括甘薦花叶病毒（Sugarcane mosaic virus,SCMV)、高梁花叶病毒（Sorghum mosaic virus,SrMV)和甘薦条纹花叶病毒 (Sugarcane sheak mosaic virus,SCSMV)等在内的48个马铃馨Υ病毒科的病毒分析表明， 在Ρ3基因内部存在一个保守结构G1-2A6-7，核糖体在该保守结构通过+2移码可W翻译出一个 大约6-7kDa的蛋白（ΡΙΡ0)，该蛋白与Ρ3蛋白的Ν端结合，形成一个大约25kDa的融合蛋白，即 P3N-PIP0。化ung等克隆了宪菁花叶病毒（Turnip mosaic virus，TuMV)的P3N-PIP0编码序 列，并通过实验证实了化MV-P3N-PIP0定位于胞间连丝。研究表明，P3N-PIP0很可能是马铃 馨Y病毒的移动蛋白，该蛋白通过与寄主因子互作，使病毒通过胞间连丝实现胞间移动，进 而对寄主建立系统性侵染（Choi等，2005; Chung等，2008; Wen等，2010; Wei等，2010; Vijayapalani 等，2012)。但是有关 SCMV-P3N-PIP0，SrMV-P3N-PIP0 和 SCSMV-P3N-PIP0 的亚 细胞定位研究还未见报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种利用高梁花叶病毒P3N-PIP0构建的亚细胞 定位试剂盒，为检测目的基因表达产物是否定位于植物胞间连丝提供指示。
[0006] 为实现本发明的目的，本发明的技术方案如下。
[0007] 利用融合PCR技术，WSrMV的P3基因编码序列为模板，克隆了P3N-PIP0的编码序 列，构建到携带不同巧光标记蛋白基因植物表达载体上，转化农杆菌，注射本氏烟叶片，在 激光共聚焦显微镜下使用相应的激光激发并采集发射光信号，即可在本氏烟上皮细胞的胞 间连丝位置上观测到清晰明亮的点状图像，证明了 P3N-PIP0定位于胞间连丝。据此，我们利 用SrMV的P3N-PIP0构建了植物亚细胞定位试剂盒。
[0008] 本发明的一种利用高梁花叶病毒P3N-PIP0构建的亚细胞定位试剂盒，其特征在于 该试剂盒由下列试剂组成：
[0009] (1)绿色巧光蛋白标记的PD定位载体pSrMV-P3N-PIP0-GFP，作为阳性对照，1管， 1 OOng/yL，50μLν管，-20 °C冷冻保存备用；
[0010] (2)红色巧光蛋白标记的PD定位载体pSrMV-P3N-PIP0-RFP，作为阳性对照，1管， 1 OOng/yL，50μLν管，-20 °C冷冻保存备用；
[0011] (3)黄色巧光蛋白标记的PD定位载体pSrMV-P3N-PIP0-YFP，作为阳性对照，1管， 1 OOng/yL，50μLν管，-20 °C冷冻保存备用；
[0012] (4)青色巧光蛋白标记的PD定位载体pSrMV-P3N-PIP0-CFP，作为阳性对照，1管， 1 OOng/yL，50μLν管，-20 °C冷冻保存备用；
[001 ；3 ] (5)载体 PSAT6-EGFP-C1，1 管，SOOng/yL，50μLν 管，-20 C 冷冻保存备用；
[0014] (6)载体 PSAT6-ERFP-C1，1 管，SOOng/yL，50μLν 管，-20 °C 冷冻保存备用；
[001 引（7)载体 PSAT6-EYFP-C1，1 管，SOOng/yL，50μLν 管，-20 C 冷冻保存备用；
[0016] (8)载体 PSAT6-ECFP-C1，1 管，SOOng/yL，50μLν 管，-20°C 冷冻保存备用；
[0017] (9)限制性内切酶趾0 1:1管，500units，100μL管，-20°C冷冻保存备用；
[001引 （10)限制性内切酶Hind 111:1管，500units，100yL/管，-20°C冷冻保存备用；
[0019 ] (11)无 RNase7jC: 2瓶，1 OOmL/瓶，4 °C 冷藏保存备用；
[0020] (12)侵染液：1管，50mL/管，-20°c冷冻保存备用；所述侵染液，包括D-葡萄糖， 250mg;MES，5ιΛ;Na3P〇4 · 12出0，5ιΛ;乙酷下香酬，如L加入dd出0至总体积50血。
[0021] 所述绿色巧光蛋白标记的PD定位载体pSrMV-P3N-PIP0-GFP的构建方法:使用趾0 巧口Hind III对载体pSAT6-EGFP-Cl(GenBank:AY818374)进行双酶切，然后用T4DNA连接酶 将酶切产物与插入片段S连接，并转化至感受态大肠杆菌化scherichia coli)D册α中，挑取 阳性克隆验证；
[0022] 所述红色巧光蛋白标记的PD定位载体pSrMV-P3N-PIP0-RFP的构建方法:使用趾0 巧口Hind III对载体pSAT6-ERFP-Cl(GenBank:DQ005474)进行双酶切，然后用T4DNA连接酶 将酶切产物与插入片段S连接，并转化至感受态大肠杆菌化scherichia coli)D册α中，挑取 阳性克隆验证；
[0023] 所述黄色巧光蛋白标记的PD定位载体pSrMV-P3N-PIP0-YFP的构建方法:使用趾0 巧口Hind III对载体pSAT6-EYFP-Cl(GenBank:AY818380)进行双酶切，然后用T4DNA连接酶 将酶切产物与插入片段S连接，并转化至感受态大肠杆菌化scherichia coli)D册α中，挑取 阳性克隆验证；
[0024] 所述青色巧光蛋白标记的PD定位载体pSrMV-P3N-PIP0-CFP的构建方法:使用趾0 巧口Hind III对载体pSAT6-ECFP-Cl(GenBank:AY818374)进行双酶切，然后用T4DNA连接酶 将酶切产物与插入片段s连接，并转化至感受态大肠杆菌化scherichia coli)D册α中，挑取 阳性克隆验证。
[0025] 所述插入片段S的核巧酸序列为序列表中SEQ ID Ν0:11所示的核巧酸序列。
[0026] 本发明的优点和有益效果:使用本发明的试剂盒可W快速将目的基因构建到带有 巧光标记的载体中，明确其表达产物是否具有胞间连丝定位的特性。本试剂盒提供了4种巧 光标记载体，为使用者提供了更多的选择，满足了研究不同基因表达产物是否共定位于胞 间连丝的需求。使用本试剂盒可W快速完成目的基因表达产物的亚细胞定位研究工作。
【附图说明】：
[0027] 图1为绿色巧光蛋白标记的载体pSrMV-P3N-PIP0-GFP的质粒图谱；
[002引图2为红色巧光蛋白标记的载体pSrMV-P3N-PIP0-RFP的质粒图谱；
[0029] 图3为黄色巧光蛋白标记的载体pSrMV-P3N-PIP0-YFP的质粒图谱；
[0030] 图4为青色巧光蛋白标记的载体pSrMV-P3N-PIP0-CFP的质粒图谱；
[0031] 图5为红色巧光标记的拟南芥AtREMl.3亚细胞定位载体pAtREM1.3-RFP的质粒图 谱；
[0032] 图6为pAtREMl. 3-RFP和pSrMV-P3N-PIP0-GFP亚细胞定位图的合并图片；
[0033] 图7为GFP载体PSAT6-EGFP-C1的亚细胞定位；
[0034] 图8为RFP载体PSAT6-ERFP-C1的亚细胞定位。
【具体实施方式】 [0035] 为了进一步阐明本发明而不是限制本发明，W下结合实施例加 W 说明。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。所述试剂和生物材料如 无特殊说明均可从商业途径获得。
[0036] 实施例一:SrMV-P3N-PIP0编码序列的克隆
[0037] 本发明利用PCR技术，克隆了高梁花叶病毒(Sor曲um mosaic virus，SrMV)的P3蛋 白编码序列；WP3基因为模板，利用融合PCR技术，克隆了SrMV的P3N-PIK)的编码序列，并将 该序列连接到带有不同巧光蛋白标记的表达载体中，获得了 4个能够特异定位于胞间联丝 的亚细胞表达载体，即绿色巧光蛋白标记的PD定位载体pSrMV-P3NPIP0-GFP，红色巧光蛋白 标记的PD定位载体pSrMV-P3NPIP0-RFP，黄色巧光蛋白标记的PD定位载体pSrMV-P3NPIP0- YFP和青色巧光蛋白标记的PD定位载体pSrMV-P3NPIP0-CFP。载体构建方法如下：
[0038] (l)SrMV-P3编码序列的获得:针对SrMV-P3的编码序列设计特异PCR引物SrMV-P3- F(上游引物)和SrMV-P3-R(下游引物），W SrMV的cDNA为模板，进行PCR扩增，将PCR产物通过 琼脂糖凝胶电泳进行分离并回收，获得SrMV-P3的编码序列。所述上游引物SrMV-P3-F的核 巧酸序列为序列表中SEQ ID NO: 1所示的核巧酸序列；下游引物SrMV-P3-R的核巧酸序列为 序列表中SEQ ID N0:2所示的核巧酸序列；SrMV-P3编码序列的核巧酸序列为序列表中SEQ ID NO:3所示的核巧酸序列；
[0039] (2) SrMV-P3N编码序列的获得:设计特异PCR引物，SrMV-P3N-F(上游引物)和SrMV- P3N-R(下游引物），在上游引物SrMV-P3N-F中引入酶切位点趾0 I。WSrMV-P3编码序列为模 板，使用引物SrMV-P3N-F和SrMV-P3N-R进行PCR扩增，反应体系为25化：10 X PCR Buf f er 2.化L，dNTPs 2 . OyL，上游引物SrMV-P3N-F( ΙΟμL?ο 1/L) 1. OyL，下游引物SrMV-P3N-R( 10μ mo 1/L) 1.0化，Taq 酶（511/化)0.125化，d地2〇 17.37扣L，模板（cDNA) 1.0化，总体积 25化。PCR 反应程序：94°C预变性4min;然后运行35个循环，94°C30s，50°C30s，72°C Imin;最后72°C lOmiruPCR反应结束后，将PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收并浓缩至4(K)ngAiL， 获得SrMV-P3N的编码序列。所述上游引物SrMV-P3N-F的核巧酸序列为序列表中SEQ ID NO: 4所示的核巧酸序列；下游引物SrMV-P3N-R的核巧酸序列为序列表中SEQ ID N0:5所示的核 巧酸序列；SrMV-P3N编码序列的核巧酸序列为序列表中SEQ ID N0:6所示的核巧酸序列； [0040] (3) SrMV-PIPO编码序列的获得：设计特异PCR引物，SrMV-PIPO-F(上游引物）和 SrMV-PIPO-R(下游引物），在下游引物SrMV-P3N-R中引入酶切位点Hind III。WSrMV-P3编 码序列为模板，使用引物SrMV-PIPO-F和SrMV-PIPO-R进行PCR扩增，反应体系为25化：10 X PCR Buffer 2.5化，dNTPs 2.0yL，上游引物SrMV-PIP0-F(10ymol/L)1.0yL，下游引物5础￥- PIP0-R (10皿01 /L) 1.0化，Taq酶（511/化)0.12 5化，d地2〇 17.3 7 扣L，模板 kDNA) 1.0化，总体 积25化。？〔3反应程序：94°C预变性4min;然后运行35个循环，94°C30s，50°C30s，72°Clmin; 最后72°C10minJCR反应结束后，将PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收并浓缩至 400ngAiL，获得SrMV-PIPO的编码序列。所述上游引物SrMV-PIPO-F的核巧酸序列为序列表 中56〇10^:7所示的核巧酸序列；下游引物5'1￥斗1口〇-如勺核巧酸序列为序列表中56〇10 N0:8所示的核巧酸序列；SrMV-PIPO编码序列的核巧酸序列为序列表中SEQ ID N0:9所示的 核巧酸序列；
[0041 ] (4)SrMV-P3N-PIP0编码序列的获得:将浓度均为40化g/化的P3N和PIP0的PCR产物 按照1:1混合作为模板，使用引物SrMV-P3N-F和SrMV-PIPO-R，利用融合PCR方法克隆SrMV- P3NPIP0编码序列。PCR反应体系为25化：10XPCR Buffer 2.5^，(1ΝΤΡ3 2.0yL，上游引物 SrMV-P3N-F( 10ymol/L) 1. OyL，下游引物SrMV-PIP〇-R( 10ymol/L) 1.0化，Taq酶（511/化） 0.12扣L，d地2〇 12.37扣L，模板（cDNA)6. OyL，总体积25化。PCR反应程序：94°C预变性4min; 然后运行35个循环，94 °C 30s，55 °C 30s，72 °C Imin;最后72 °C lOmin JCR反应结束后，将PCR产 物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离并回收，获得SrMV-P3N-PIP0的编码序列。所述SrMV-P3N- PIP0编码序列的核巧酸序列为序列表中SEQ ID NO: 10所示的核巧酸序列；
[0042] (5)插入片段S的获得:使用化0巧日化nd III对SrMV-P3N-PIP0编码序列进行双酶 切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离并回收，获得插入片段S;所述插入片段S的核 巧酸序列为序列表中SEQ ID NO: 11所示的核巧酸序列；
[0043] (6)绿色巧光蛋白标记的PD定位载体pSrMV-P3N-PIP0-GFP的构建:使用趾0 I和 Hind III对载体pSAT6-EGFP-Cl(GenBank:AY818374)进行双酶切，将酶切产物通过琼脂糖 凝胶电泳进行分离并回收。然后用T4DNA连接酶将酶切产物与插入片段S连接，并将连接产 物转化至感受态大肠杆菌化schericMa coli)D册α中，挑取阳性克隆验证，得到绿色巧光 蛋白标记的PD定位载体pSrMV-P3N-PIP0-GFP，其质粒图谱如图1所示；
[0044] (7)红色巧光蛋白标记的PD定位载体pSrMV-P3N-PIP0-RFP的构建:使用趾0 I和 Hind III对载体PSAT6-ERFP-C1 (GenBank:DQ005474)进行双酶切，将酶切产物通过琼脂糖 凝胶电泳进行分离并回收。然后用T4DNA连接酶将酶切产物与插入片段S连接，并将连接产 物转化至感受态大肠杆菌化scherichia coli)D册α中，挑取阳性克隆验证，得到红色巧光 蛋白标记的PD定位载体pSrMV-P3N-PIP0-RFP，其质粒图谱如图2所示；
[0045] (8)黄色巧光蛋白标记的PD定位载体pSrMV-P3N-PIP0-YFP的构建:使用趾0 I和 Hind III对载体pSAT6-EYFP-Cl(GenBank:AY818380)进行双酶切，将酶切产物通过琼脂糖 凝胶电泳进行分离并回收。然后用T4DNA连接酶将酶切产物与插入片段S连接，并将连接产 物转化至受态大肠杆菌化scherichia coli)D册α中，挑取阳性克隆验证，得到黄色巧光蛋 白标记的PD定位载体pSrMV-P3N-PIP0-YFP，其质粒图谱如图3所示；
[0046] (9)青色巧光蛋白标记的PD定位载体pSrMV-P3N-PIP0-CFP的构建:使用趾0 I和 Hind III对载体pSAT6-ECFP-Cl(GenBank:AY818374)进行双酶切，将酶切产物通过琼脂糖 凝胶电泳进行分离并回收。然后用T4DNA连接酶将酶切产物与插入片段S连接，并将连接产 物转化至感受态大肠杆菌化scherichia coli)D册α中，挑取阳性克隆验证，得到青色巧光 蛋白标记的PD定位载体pSrMV-P3N-PIP0-CFP，其质粒图谱如图4所示。
[0047] 实施例二:拟南芥AtREMl .3的亚细胞定位
[004引 1、拟南芥AtREMl. 3基因的克隆
[0049] 从拟南芥中克隆了一个Remorin基因，将其克隆到克隆载体PMD19-T中。进化树分 析表明该基因属于Remorin基因家族的第1亚群的第巧中类型，命名为AtREMl. 3。文献表明 Remorin可W定位于质膜和胞间连丝，但是生物信息学分析表明，Remorin没有跨膜结构域 和信号肤。为验证AtREMl. 3是可W定位于胞间连丝，使用本试剂盒对其进行亚细胞定位研 究。所述AtREMl.3编码序列的核巧酸序列为序列表中SEQ ID NO: 12所示的核巧酸序列；
[00加]2、亚细胞定位载体pAtREMl. 3-RFP的构建
[0051 ] (1)设计特异PCR引物，AtREM1.3-F(上游引物）和AtREM1.3-R(下游引物），在上游 引物AtREMl. 3-F中引入酶切位点化0 I，在下游引物AtREMl. 3-R中引入酶切位点化nd III。 使用该对引物，WAtREMl. 3基因的克隆载体为模板，进行PCR扩增。PCR反应体系为25化：10 XPCR Buffer 2.5^，(1ΝΤΡ8 2.0yL，上游引物AtREM1.3-F(10ymol/L)1.0yL，下游引物 AtREMl. 3-R(10皿01 /L) 1.0化，Taq酶巧U/化）0.125化，d地2〇 17.37扣L，模板（cDNA) 1.0化， 总体积25化。PCR反应程序:94°C预变性4min;然后运行35个循环，94°C 30s，50°C 30s，72°C Imin;最后72°ClOminePCR反应结束后，使用趾o巧日化nd III对PCR产物进行双酶切，将酶 切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离并回收，获得插入片段InsTarget;所述上游引物 AtREM1.3-F的核巧酸序列为序列表中SEQ ID N0:13所示的核巧酸序列；下游引物 AtREMl. 3-R的核巧酸序列为序列表中SEQ ID NO: 14所示的核巧酸序列；插入片段 Ins化rget的核巧酸序列为序列表中SEQ ID NO: 15所示的核巧酸序列；
[0化2] (2)取RFP对照载体，使用趾0 I和化nd III对载体PSAT6-ERFP-C1进行双酶切，将 酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离并回收。然后用T4DNA连接酶将酶切产物与插入片 段InsTarget连接，并将连接产物转化至感受态大肠杆菌(^Escherichia coli )D册α中，?兆取 阳性克隆验证，得到红色巧光蛋白标记的PD定位载体pAtREM1.3-RFP，其质粒图谱如图5所 示；
[0化3] 3、亚细胞定位实验
[0054] (1)采用液氮冻融法，分别将亚细胞定位载体pAtREMl. 3-RFP和GFP标记的PD定位 载体pSrMV-P3N-PIP0-GFP转入感受态的农杆菌EHA105菌株中；在5mL LB培养基(含Rif，34μ g/rnL Kan，50yg/mL)中培养转化的农杆菌，28 °C，200巧m培养过夜；
[0化日](2)常溫下，5,000巧m，离屯、5min，弃上清，加入ImL侵染液重悬菌液；
[0056] (3)重复步骤(2)，洗去培养基中含有的抗生素；
[0057] (4)加入ImL侵染液，现憶菌液0〇6日日，并调节0〇6日日值至0.1;
[005引（5)取75化L菌液于2mL无菌离屯、管中，混匀，放置3~化；将含有亚细胞定位载体 pAtREMl. 3-GFP的菌液和含有YFP标记载体的菌液等比混匀，进行侵染实验；
[0059] (6)取健康本氏烟植株(在侵染前，光照处理烟草化），选择两片大的叶片，在烟草 叶片背面(两个叶脉间)注射菌液并做好标记；
[0060] (7)把侵染过的烟草放在正常条件下培养。2天后取侵染叶片l-2cm2,背面朝上，用 激光共聚焦显微镜观察。在采集巧光信号时，对同一个细胞分别采集不同巧光信号。待检测 的pAtREM1.3-RFP标记的是红色巧光蛋白，采集红色巧光蛋白信号时，在箭头所示位置会出 现亮点，表明AtREMl. 3在细胞膜上表达，但是无法确定其定位于PD;本试剂盒提供PD定位载 体pSrMV-P3N-PIP0-GFP标记的是绿色巧光蛋白，采集绿色巧光信号时，也会出现亮点，表明 亮点所在位置即为胞间连丝；当把两张图片合并时，红色亮点和绿色亮点准确叠加后显示 为黄色的亮点，表明AtREMl.3定位于胞间连丝，如图6所示。
[0061 ] (8)按照上述程序和方法，将GFP载体PSAT6-EGFP-C1和RFP载体PSAT6-ERFP-C1在 本氏烟叶片表皮细胞中表达，激光共聚焦显微镜下检测巧光信号。绿色巧光信号为散布状 态（图7)，红色巧光信号为散布状态（图8)，表明绿色巧光蛋白和红色巧光蛋白没有特异的 亚细胞定位，目标蛋白的亚细胞定位不是绿色或红色巧光蛋白引起的，由此，证明AtREMl.3 可W定位于胞间连丝。
[0062]所述琼脂糖凝胶电泳，参照《分子克隆实验指南》(第二版)第六章第一节中琼脂糖 凝胶电泳的方法;所述将连接产物转化至感受态大肠杆菌D册α中，转化方法参照《分子克隆 实验指南》(第二版)第一章第五节中用氯化巧制备和转化感受态大肠杆菌的方法;所述含 有阳性克隆的菌落的挑取，参照《分子克隆实验指南》(第二版)第一章第六节中含重组质粒 的细菌菌落的鉴定方法;所述提取质粒DNA的方法，参照质粒提取试剂盒说明书;所述酶切 方法，参照限制性内切酶的说明书;所述回收方法，参照胶回收试剂盒说明书;所述用Τ4- DNA连接酶进行连接方法，参照T4-DNA连接酶操作说明书。
【主权项】
1. 一种利用高粱花叶病毒P3N-PIP0构建的亚细胞定位试剂盒，其特征在于该试剂盒由 下列试剂组成： (1) 绿色荧光蛋白标记的ro定位载体pSrMV-P3N-PIP0-GFP，作为阳性对照，1管，lOOng/ yL，50yL/管，-20°C冷冻保存备用； (2) 红色荧光蛋白标记的定位载体pSrMV-P3N-PIP0-RFP，作为阳性对照，1管，lOOng/ yL，50yL/管，-20°C冷冻保存备用； (3) 黄色荧光蛋白标记的定位载体pSrMV-P3N-PIP0-YFP，作为阳性对照，1管，lOOng/ yL，50yL/管，-20°C冷冻保存备用； (4) 青色荧光蛋白标记的定位载体pSrMV-P3N-PIP0-CFP，作为阳性对照，1管，lOOng/ yL，50yL/管，-20°C冷冻保存备用； (5) 载体pSAT6-EGFP-Cl，1 管，500ng/yL，50yL/管，-20 °C冷冻保存备用； (6) 载体pSAT6-ERFP-Cl，1管，500ngAxL，50yL/管，-20°C冷冻保存备用； (7) 载体pSAT6-EYFP-Cl，1 管，500ngAxL，50yL/管，-20 °C冷冻保存备用； (8) 载体pSAT6-ECFP-Cl，1 管，500ng/yL，50yL/管，-20 °C冷冻保存备用； (9) 限制性内切酶 Xho 1:1管，500units，100yL/管； (10) 限制性内切酶 Hind 111:1管，500units，100yL/管； (11) 无 RNase 水:2瓶，100mL/瓶； (12) 侵染液：1管，50mL/管，-20 °C冷冻保存备用。2. 根据权利要求1所述的一种利用高粱花叶病毒P3N-PIP0构建的亚细胞定位试剂盒， 其特征在于所述绿色荧光蛋白标记的PD定位载体pSrMV-P3N-PIP0-GFP的构建方法:使用 Xho I和Hind III对载体pSAT6-EGFP-Cl进行双酶切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行 分离并回收;然后用T4DNA连接酶将酶切产物与插入片段S连接，并将连接产物转化至感受 态大肠杆菌(Escherichia coli )DH5a中，挑取阳性克隆验证，得到绿色焚光蛋白标记的PD 定位载体pSrMV-P3N-PIP0-GFP;所述插入片段S的核苷酸序列为序列表中SEQIDN0:ll所 示的核苷酸序列。3. 根据权利要求1所述的一种利用高粱花叶病毒P3N-PIP0构建的亚细胞定位试剂盒， 其特征在于所述红色荧光蛋白标记的PD定位载体pSrMV-P3N-PIP0-RFP的构建方法:使用 Xho I和Hind III对载体pSAT6-ERFP-Cl进行双酶切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行 分离并回收;然后用T4DNA连接酶将酶切产物与插入片段S连接，并将连接产物转化至感受 态大肠杆菌DH5a中，挑取阳性克隆验证，得到红色荧光蛋白标记的PD定位载体pSrMV-P3N-PIP0-RFP;所述插入片段S的核苷酸序列为序列表中SEQIDN0 :11所示的核苷酸序列。4. 根据权利要求1所述的一种利用高粱花叶病毒P3N-PIP0构建的亚细胞定位试剂盒， 其特征在于所述黄色荧光蛋白标记的PD定位载体pSrMV-P3N-PIP0-YFP的构建方法:使用 Xho I和Hind III对载体pSAT6-EYFP-Cl进行双酶切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行 分离并回收;然后用T4DNA连接酶将酶切产物与插入片段S连接，并将连接产物转化至感受 态大肠杆菌DH5a中，挑取阳性克隆验证，得到黄色荧光蛋白标记的PD定位载体pSrMV-P3N-PIP0-YFP;所述插入片段S的核苷酸序列为序列表中SEQIDN0 :11所示的核苷酸序列。5. 根据权利要求1所述的一种利用高粱花叶病毒P3N-PIP0构建的亚细胞定位试剂盒， 其特征在于所述青色荧光蛋白标记的PD定位载体pSrMV-P3N-PIP0-CFP的构建方法:使用 Xho I和Hind 111对载体?5纟1640?卩-(：1进行双酶切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行 分离并回收;然后用T4DNA连接酶将酶切产物与插入片段S连接，并将连接产物转化至感受 态大肠杆菌DH5a中，挑取阳性克隆验证，得到青色荧光蛋白标记的PD定位载体pSrMV-P3N-PIP0-CFP;所述插入片段S的核苷酸序列为序列表中SEQIDN0 :11所示的核苷酸序列。
【文档编号】C12Q1/02GK105823890SQ201610217176
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年4月8日
【发明人】杨永庆, 程光远, 彭磊, 徐倩, 董萌, 徐景升, 翟玉山, 邓宇晴, 郑艳茹, 高世武, 郭晋隆
【申请人】福建农林大学