一种pH调控的双酶电化学生物传感器及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种pH调控的双酶电化学生物传感器及其制备方法，包括：PAA?PBA的合成，PAA?PBA是由聚丙烯酸与3?氨基苯硼酸半硫酸盐在交联剂N?羟基丁二胺磺酸钠和N?(3?二甲氨基丙基)?N'?乙基?碳二亚胺盐酸盐存在的条件下发生缩合反应而生成；将石墨电极打磨后，在二次水中超声30 s，吹干后即可作为使用的工作电极。本发明首次制备通过硼酸?二醇特异性识别作用构筑的层层组装(layer?by?layer,LbL)双酶薄膜在pH可控的生物电催化中应用；获得了pH调控的双酶电化学生物传感器，在热解石墨(PG)电极上构筑了{PAA?PBA/HRP/PAA?PBA/GOD}n LbL薄膜。
【专利说明】
一种pH调控的双酶电化学生物传感器及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物传感器技术领域，尤其涉及一种pH调控的双酶电化学生物传感器 及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 基于酶反应的电化学生物传感器由于酶的高选择性和酶催化反应的高灵敏度而 引起了研究者们的广泛关注。在这类生物传感器中，将两种或多种酶固定在同一电极表面 是特别令人感兴趣的，这不仅是因为其在分析应用中的性能可以获得改善，而且还可以帮 助人们更好地理解真实生命体系中酶反应的机理。双酶或者多酶耦合的电催化反应可以模 拟细胞中多种酶之间发生的连续电子转移反应，并为生命体系中多酶催化反应的机理研究 提供工作模型。用于测定葡萄糖的辣根过氧化物酶(HRP)和葡萄糖氧化酶(G0D)的双酶电化 学生物传感器最早是由Kulys等提出的，并在此后得到了快速的发展。现今，葡萄糖的测定 在许多实际工作中都有着非常重要的意义，例如临床中糖尿病的诊断，食品工业中废水的 处理等。因此HRP/G0D双酶电极具有其内在的吸引力和独特的优势。在此体系中，GOD在氧的 存在下催化氧化葡萄糖，现场生成的H 2O2可以作为第二种酶HRP的底物，并在溶液中电活性 媒介体的作用下在电极表面被HRP催化还原为水。通过这样的双酶催化反应，葡萄糖的检测 原理便从原来单独采用GOD时的电化学催化氧化过程转变为在较温和的电位条件下发生的 H2O2的电化学催化还原过程，由此可以避免某些共存的电活性物质的干扰，使传感器的选择 性得到极大的提高。此外，这种方法还可以避免高浓度H 2O2对HRP的损伤。然而，基于双酶体 系的PH开关的生物电催化传感器报道很少。
[0003] 通过硼酸-二醇特异性作用，由两种糖基酶和含有PBA基团的聚合物构筑可调控的 双酶传感器薄膜电极属于技术空白。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种pH调控的双酶电化学生物传感器及其制备方法，旨在 解决以硼酸-二醇特异性作用为成膜驱动力，由含有PBA基团的聚合物和糖基酶(HRP和G0D) 构筑可调控的双酶传感器薄膜电极属于技术空白的问题。
[0005] 本发明是这样实现的，一种pH调控的双酶电化学生物传感器的制备方法，所述pH 调控的双酶电化学生物传感器的制备方法包括以下步骤： 步骤一，PAA-PBA的合成，PAA-PBA是由丙烯酸(PAA)与3-氨基苯硼酸半硫酸盐(PBA)在 交联剂N-羟基丁二胺磺酸钠(NHS)和N-(3-二甲氨基丙基)-N'_乙基-碳二亚胺盐酸盐(EDC) 存在的条件下发生缩合反应而生成；各反应组分的比例分别为：54% PAA，21.5% PBA， 2.3% NHS, 22% EDC0
[0006] 步骤二，将石墨电极在600目的金相砂纸打磨后，在二次水中超声30 s，吹干后即 可作为使用的工作电极。
[0007] 进一步，所述PAA-PBA的合成的化学方程式如下：
进一步，所述PAA-PBA的合成的具体步骤如卜： 第一步，将0.57 g的PAA水溶液用4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液(20 mL，50 mM)稀释， PAA水溶液含有2.77 mmol单体;并将pH调至8.5;将3-氨基苯硼酸半硫酸盐(20 mL，61 mM) 同样溶于pH 8.5的4-羟乙基哌嗪乙磺酸99.5%缓冲溶液(20 mL，50 mM)中；然后两种溶液混 合； 第二步，逐滴加入含有N-羟基丁二胺磺酸钠（4 mL，31 mM)的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓 冲溶液(50 mM，pH 8.5)，并搅拌 10 min; 第三步，将含有N-(3-二甲氨基丙基)-N'_乙基-碳二亚胺盐酸盐(4 mL，310 mM)的4-羟 乙基哌嗪乙磺酸溶液(50 mM，pH 8.5)加入混合溶液中，室温下搅拌12 h; 第四步，将溶液透析一周以除去所有小分子量的杂质，冷冻干燥后得到产物PAA-PBA， 为白色粉末状固体。
[0008] 进一步，所述步骤二具体包括： 第一步，将处理好的带有负电荷的PG电极首先浸入带有正电荷的壳聚糖CS溶液（I mg mL-S pH 5.0)中20 min，在PG表面形成一层CS前驱膜； 第二步，然后将PG/CS电极交替浸入PAA-PBA (I mg mL-SpH 9.0)、辣根过氧化物HRP (I mg mL-SpH 7.4,等电点为8.9)、葡萄糖氧化酶GOD (I mg mL-SpH 7.4,等电点为4.2) 水溶液中各30 min。
[0009] 第三步，每次溶液转换后均用水清洗并吹干，PAA-PBA能够和两种糖酶HRP和GOD通 过硼酸-二醇特异性识别作用相结合，在PG/CS表面形成了 PAA-PBA/HRP/PAA-PBA-GOD四个 单层的LbL薄膜； 第四步，主要通过PAA-PBA和糖基酶之间的硼酸-二醇特异性相互作用，重复第一步-第 三步直到形成所需的四层数(η )，表示为{PAA-PBA/HRP/PAA-PBA-GOD} n。
[0010] 本发明的另一目的在于提供一种所述pH调控的双酶电化学生物传感器的制备方 法制备的PH调控的双酶电化学生物传感器，所述pH调控的双酶电化学生物传感器包括:聚 合物PAA-PBA和含有糖残基的辣根过氧化物酶和葡萄糖氧化酶。采用石英晶体微天平的监 测了薄膜电极{PAA-PBA/HRP/PAA-PBA/GOD} 4 上组装的PAA-PBA、HRP、G0D 的质量分别为 1392 ng， 626 ng， 557 ng〇
[0011] 本发明的另一目的在于提供一种生物电化学催化方法，所述方法包含所述pH调控 的双酶电化学生物传感器的制备方法制备的pH调控的双酶电化学生物传感器。
[0012] 本发明提供的pH调控的双酶电化学生物传感器及其制备方法，合成了既含有I3BA 基团又含有"自由的"羧酸基团的聚电解质PAA-PBA;其中硼酸基团可以分别与糖酶HRP和 GOD表面的甘露糖和葡萄糖糖残基以"硼酸-二醇"特异性相互作用为成膜驱动力，而不受限 于静电作用驱动力，在石墨电极表面构筑层层组装薄膜;同时，PAA-PBA分子中大量的"自由 的"羧基城 3约为6.0)可以根据环境pH值的不同而带有不同的电荷，表现出pH敏感的刺激-响应性质。通过PAA-PBA和HRP、G0D双酶表面的糖基酶二者之间的硼酸-二醇特异性识别作 用在电极表面成功构筑了 {PAA-PBA/HRP/PAA-PBA-GOD}n层层组装双酶薄膜，实现了双酶 在电极上的固定；该薄膜对媒介体电活性分子例如Fe(CN) 63、氯化六氨合钌（III)(Ru (NH3)6Cl3),亚甲基蓝MB，表现出pH敏感开关电化学行为;双酶电极的这种对媒介体电活性 分子PH开关性质可以被进一步应用于pH调控的以电活性小分子为媒介体的GOD对葡萄糖的 电化学催化氧化。
[0013] 本发明首次制备通过硼酸-二醇特异性识别作用构筑的LbL双酶薄膜在pH可控的 葡萄糖生物电催化氧化中的应用；获得了新型的PH调控的双酶电化学生物传感器。本发明 通过合成的聚合物PAA-PBA和含有糖残基的双酶(辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶)之间的 硼酸-糖基酶特异性相互作用在PG电极上成功构筑了 {PAA-PBA/HRP/PAA-PBA-GOD}n LbL薄 膜;该薄膜对媒介体电活性分子例如Fe(CN)63、氯化六氨合钌（III) (Ru(NH3)6C13)，亚甲基 蓝MB表现出pH敏感的开关性质;双酶薄膜对探针分子的pH开关性质可以被用于控制和调节 葡萄糖的生物电化学催化;双酶体系的PH可调控开关行为的研究将为发展新型的pH可控的 电化学生物传感器提供了新的模型。
[0014] 本发明的产物PAA-PBA不但具有可以与糖基酶通过硼酸-二醇特异性相互作用识 别的硼酸基团，而且具有与PAA相似的聚合物结构，其链上带有剩余的-COOH基团。根据PAA-PBA的元素分析结果，估算出PAA-PBA中接枝有PBA的PAA羧基的含量大约为41%，在经过交联 反应后，PAA-PBA分子中仍然有相当数量的-COOH是未与I 3BA反应的或"自由"的。PAA-PBA组 分之所以对pH很敏感，这是因为其含有相当量的对环境pH敏感的自由的-COOH基团。由于 PAA的pKa约为6.0,因此在pH > 6.0时，羧基会发生离子化，使PAA-PBA带有负电荷;在pH〈 6.0时，由于羧基的质子化而不带电荷。打磨后的plane PG电极暴露出一些edge面，因此既 具有疏水性也具有一定亲水性。由于edge面的碳被氧化后连接有0-，0!Γ等基团，因此表面带 一定负电荷。
[0015] 本发明主要通过PAA-PBA和糖基酶之间的硼酸-二醇特异性相互作用，重复第一 步-第三步直到形成所需的四层数(η)，表示为{PAA-PBA/HRP/PAA-PBA-GOD} η，这种薄膜的 组装目前未有文献报道，在业内属于技术空白。
[0016]
【附图说明】
[0017] 图1是本发明实施例提供的pH调控的双酶电化学生物传感器的准备方法流程图。
【具体实施方式】
[0018] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明 进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于 限定本发明。
[0019] 下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。
[0020] 如图1所示，本发明实施例的PH调控的双酶电化学生物传感器的制备方法包括以 下步骤： S101:将0.57 g的PAA水溶液(含有2.77 mmol单体)用HEPES缓冲溶液(20 mL，50 mM) 稀释，并将pH调至8.5;将APBA (20 mL，61 mM)同样溶于pH 8.5的4-羟乙基哌嗪乙磺酸 (HEPES，99.5%)缓冲溶液（20 mL，50 mM)中； S102:然后将上述两种溶液混合，逐滴加入含有NHS (4 mL，31 mM)的HEPES缓冲溶液 (50 mM，pH 8.5)，并搅拌 10 min，将含有EDC (4 mL，310 mM)的HEPES溶液（50 mM，pH 8.5) 加入上述混合溶液中，室温下搅拌12 h; S103:将上述溶液透析一周以除去所有小分子量的杂质，冷冻干燥后得到产物PAA-PBA，为白色粉末状固体； S104:将石墨电极(PG)在600目的金相砂纸打磨后，在二次水中超声30 s，吹干后即可 作为实验中使用的工作电极，将处理好的PG电极首先浸入带有正电荷的壳聚糖CS溶液（1 mg mL-S pH 5.0)中20 min，使之在PG表面形成一层CS前驱膜； S105:将PG/CS电极交替浸入PAA-PBA (I mg mL-SpH 9.0)、HRP(1 mg mL-^pH 7.4)、 Con A和GOD (I mg mL'pH 7.4)水溶液中各30 min，每次溶液转换后均用水清洗并吹干， 在PG/CS表面形成了 PAA-PBA/HRP/PAA-PBA-GOD四个单层的LbL薄膜，重复上述过程直到形 成所需的四层数(η)，表示为{PAA-PBA/HRP/PAA-PBA-GOD} n。
[0021] 下面结合具体实施例对本发明的应用原理作进一步的描述。
[0022] I. PAA-PBA的合成 PAA-PBA是由丙烯酸(PAA)与3-氨基苯硼酸半硫酸盐(APBA)在交联剂N-羟基丁二胺磺 酸钠(NHS)和N-(3-二甲氨基丙基)-N'_乙基-碳二亚胺盐酸盐(EDC)存在的条件下发生缩合 反应而生成的，其合成路线可用Scheme 5-1来表示。其过程为，将0.57 g的PAA水溶液(含有 2.77 mmol单体）用HEPES缓冲溶液（20 mL，50 mM)稀释，并将pH调至8.5;将APBA (20 mL， 61 mM)同样溶于pH 8.5的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES，99.5%)缓冲溶液（20 mL，50 mM)中； 然后将上述两种溶液混合。逐滴加入含有NHS (4 mL，31 mM)的HEPES缓冲溶液(50 mM，pH 8.5)，并搅拌10 min。将含有EDC (4 mL，310 mM)的HEPES溶液（50 mM，pH 8.5)加入上述混 合溶液中，室温下搅拌12 h。然后将上述溶液透析一周以除去所有小分子量的杂质，冷冻干 燥后得到产物PAA-PBA，为白色粉末状固体； 合成路线如下：
2薄膜的组装 将石墨电极(PG)打磨后，在二次水中超声30 s，吹干后即可作为实验中使用的工作电 极。将处理好的PG电极首先浸入带有正电荷的CS溶液(I mg mL1，pH 5.0)中20 min，使之 在PG表面形成一层CS前驱膜。然后将PG/CS电极交替浸入PAA-PBA (I mg mL'pH 9.0)、HRP (I mg mL-SpH 7.4)、Con A和GOD (I mg mL-SpH 7.4)水溶液中各30 min，每次溶液转换 后均用水清洗并吹干，这样就在PG/CS表面形成了 PAA-TOA/HRP/PAA-PBA-GOD四个单层的 LbL薄膜。重复上述过程直到形成所需的四层数(η)，表示为{PAA-PBA/HRP/PAA-PBA-GOD}n。 在组装过程中，吹干步骤通常是必要的，这样可以使LbL薄膜更加稳定。
[0023]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精 神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种pH调控的双酶电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，所述pH调控的双酶 电化学生物传感器的制备方法包括W下步骤： 步骤一，PAA-PBA的合成，PAA-PBA是由聚丙締酸与3-氨基苯棚酸半硫酸盐在交联剂N- 径基下二胺横酸钢和N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基-碳二亚胺盐酸盐存在的条件下发生缩 合反应而生成；按照质量比各反应组分的比例分别为：54%聚丙締酸，21.5% 3-氨基苯棚 酸半硫酸盐，2.3% N-径基下二胺横酸钢，22% N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基-碳二亚胺 盐酸盐； 步骤二，将石墨电极在600目的金相砂纸上打磨后，在二次水中超声30 S，吹干后即作 为使用的工作电极。2. 如权利要求1所述的抑调控的双酶电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，所述 PAA-PBA的合成的化学方程式如下：3. 如权利要求1所述的抑调控的双酶电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，所述 PAA-PBA的合成的具体步骤如下： 第一步，将0.57 g的PAA水溶液用4-径乙基赃嗦乙横酸缓冲溶液稀释，PAA水溶液含有 2.77 mmol单体;并将抑调至8.5;将3-氨基苯棚酸半硫酸盐同样溶于pH 8.5的4-径乙基赃 嗦乙横酸99.5%缓冲溶液中；然后两种溶液混合； 第二步，逐滴加入含有N-径基下二胺横酸钢的4-径乙基赃嗦乙横酸缓冲溶液，并揽拌 10 min; 第Ξ步，将含有N-(3-二甲氨基丙基）-N'-乙基-碳二亚胺盐酸盐的4-径乙基赃嗦乙横 酸溶液加入混合溶液中，室溫下揽拌12 h; 第四步，将溶液透析一周W除去所有小分子量的杂质，冷冻干燥后得到产物PAA-PBA， 为白色粉末状固体。4. 如权利要求1所述的抑调控的双酶电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，所述 步骤二具体包括： 第一步，将处理好的PG电极首先浸入带有正电荷的壳聚糖溶液（中20 min,在PG表面形 成一层CS前驱膜； 第二步，然后将PG/CS电极交替浸入PAA-PBA、辣根过氧化物酶、Con A和葡萄糖氧化酶 水溶液中各30 min; 第Ξ步，每次溶液转换后均用水清洗并吹干，在PG/CS表面形成了 PAA-PBA/HRP/PAA- PBA-GOD四个单层的化L薄膜； 第四步，重复第一步-第Ξ步直到形成所需的层数η，表示为{PAA-PBA/HRP/PAA-PBA- GOD}。。5. -种如权利要求1所述P的周控的双酶电化学生物传感器的制备方法制备的抑调控的 双酶电化学生物传感器，其特征在于，所述pH调控的双酶电化学生物传感器包括：聚合物 PAA-PBA和含有糖残基的辣根过氧化物酶和葡萄糖氧化酶，W及PAA-PBA与含有糖残基的糖 基酶之间构筑薄膜的驱动力棚酸-二醇特异性相互相互作用。6. -种生物电化学催化方法，其特征在于，所述方法包含权利要求1-4任意一项所述抑 调控的双酶电化学生物传感器的制备方法制备的抑调控的双酶电化学生物传感器。
【文档编号】G01N27/327GK105842317SQ201610314562
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年5月13日
【发明人】姚惠琴, 史可人, 韦洁, 许红平, 彭娟, 王明科
【申请人】宁夏医科大学