一种简便的gc法测定人血白蛋白中辛酸钠含量的方法
【专利摘要】本发明公开一种简便的GC法测定人血白蛋白中辛酸钠含量的方法，其特征在于：在采用三氯甲烷制备样品时简便，系统适用性，专属性，定量限，线性，准确度，精密度，耐用性，符合《中国药典》药品质量标准分析方法验证指导原则和《药品GMP指南·质量控制实验室与物料系统》的要求。本发明对现行的采用气相色谱法测定人血白蛋白中辛酸钠含量的方法进行了改进，并且对改进后的方法进行系统适用性、准确度、精密度、专属性、定量限、线性及耐用性的验证，确保该分析方法能够满足测定要求，具有不需要将三氯甲烷挥发干、操作时间短、增加了实验效率、有机相体积为1.0 mL和操作偏差小的特点。
【专利说明】
一种简便的GC法测定人血白蛋白中辛酸钠含量的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种生物制品的测定方法，特别是涉及一种简便的GC法测定人血白蛋 白中辛酸钠含量的方法，本发明采用气相色谱法检测人血白蛋白中辛酸钠的含量，优化了 检测方法，并对新的方法进行验证。
【背景技术】
[0002] 辛酸钠被广泛用于人血白蛋白的稳定剂，它在人血白蛋白加热保温过程中能够起 稳定和保护作用，防止白蛋白的变性，确保制品有良好的外观。然而，辛酸钠有一定的毒性， 需控制其在人白蛋白中的含量。《中国药典》规定每Ig蛋白质中应为〇. 140~0.180mmol。
[0003] 《中国药典》已经收录了辛酸钠测定法(附录VI K)，但该方法制备样品需要将三氯 甲烷挥发至干，并且样品的终体积是1〇〇此。操作时间较长并且容易在检测中产生偏差，因 此，本发明对药典方法进行了改变和优化，根据《中国药典》药品质量标准分析方法验证指 导原则和《药品GMP指南?质量控制实验室与物料系统》的要求，非药典分析方法或方法发 生改变，应进行验证后才能使用。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的就在于解决现有技术存在的上述不足，经过大量试验和反复研究， 给出了一种简便的GC法测定人血白蛋白中辛酸钠含量的方法。本发明对现行的采用GC法测 定人血白蛋白中辛酸钠含量的方法进行了改进，并且对改进后的方法进行系统适用性、准 确度、精密度、专属性、定量限、线性及耐用性的验证，确保该分析方法能够满足测定要求， 具有不需要将三氯甲烷挥发干、操作时间短、增加了实验效率、有机相体积为1.0 mL和操作 偏差小的特点。
[0005] 本发明给出的技术解决方案是，这种简便的GC法测定人血白蛋白中辛酸钠含量的 方法，其特征在于:其测定方法如下。
[0006] 由以下步骤组成。
[0007] 1.取人血白蛋白一批次1瓶，作为方法验证供试品。
[0008] 溶液配制。
[0009] 1.5111〇1/1高氯酸溶液:取高氯酸12.2 1^，加超纯水定容至10〇111匕 [0010]正庚酸溶液:精密称定0.2 g，用三氯甲烷定容至10 mL，浓度为20 mg/mL。
[0011] 正辛酸溶液:精密称定0.5 g，用三氯甲烷定容至10 mL，浓度为50 mg/mL。
[0012] 线性溶液:分别量取正辛酸溶液120 yL、300 yL、500 yL、700 yL、900 yL，各加入 正庚酸溶液1.0 mL，分别用三氯甲烧定容至10 mL，辛酸线性浓度为0.6 mg/mL、1.5 mg/mL、 2.5 mg/mL、3.5 mg/mL、4.5 mg/mL〇
[0013] 定量限溶液:取辛酸线性浓度为0.6 mg/mL溶液1.0 mL，用三氯甲烷定容至10 mL。
[0014] 标准品溶液:取辛酸线性浓度为3.5 mg/mL溶液作为标准品溶液。
[0015]内标溶液:取正庚酸溶液2.5 mL，用三氯甲烷定容至25 mL。
[0016] 精密度溶液:量取人血白蛋白500 yL加水500 yL，加1.5 mol/L高氯酸溶液400 μ L，振荡混匀2分钟，加1.0 mL内标溶液，振荡混匀2分钟，以3000转/分钟，离心20分钟。平行 制备6份，取下层有机溶液进样。
[0017] 准确度溶液:分别量取人血白蛋白600 yL加水400 yL(120%溶液）、400 yL加水600 μΚ80%溶液），混匀，各加1.5 mol/L高氯酸溶液400 yL，振荡混匀2分钟，各加1.0 mL内标溶 液，振荡混匀2分钟，以3000转/分钟，离心20分钟。分别平行制备3份，取下层有机溶液进样。
[0018] 供试品溶液:精密度溶液作为供试品溶液。
[0019] 空白溶液:取三氯甲烷作为空白溶液。
[0020] 试验条件(仪器参数）。
[0021] 色谱柱:DB-FFAP( 123-3232)，0· 32 mm*30 m。
[0022] FID:23(TC。
[0023] 进样口 ：23(TC。
[0024] 炉温：16(TC。
[0025] 载气:氮气。
[0026] 流速:2.0 mL/min。
[0027] 进样量:0.1 yL。
[0028] 运行时间：10分钟。
[0029]结果计算。
[0030]标准品溶液中辛酸峰与庚酸峰的分离度均应大于1.5,辛酸峰与庚酸峰面积之比 的RSD应不大于5 %。以线性溶液中辛酸峰与庚酸峰面积比对辛酸浓度(mg/mL)作直线回归， 求得直线回归方程，直线回归相关系数应不低于0.99,计算出供试品溶液中辛酸的浓度 (m g / m L )，结果计算中除辛酸峰与庚酸峰以外，其他的峰可忽略不计。再按下式计算供试品 中辛酸钠含量。
[0031]辛酸钠含量(mmol/g蛋白质）。
[0032]式中:A为供试品溶液中辛酸的浓度，mg/m。
[0033] η为供试品溶液的稀释倍数(1/供试品的取用量，以mL计算）。
[0034] 144.22为辛酸分子量(I mmol辛酸相当于I mmol辛酸钠）。
[0035] C为供试品蛋白质含量，g/mL。
[0036]本发明在采用三氯甲烷制备样品时简便，系统适用性，专属性，定量限，线性，准确 度，精密度，耐用性，符合《中国药典》药品质量标准分析方法验证指导原则和《药品GMP指 南?质量控制实验室与物料系统》的要求。
[0037]所述的三氯甲烷制备样品时不需要将三氯甲烷挥发至干。
[0038] 所述的系统适用性:标准品溶液中辛酸峰与庚酸峰的分离度均应大于1.5,标准品 溶液中辛酸峰与庚酸峰面积之比的RSD应不大于5 %，标准品溶液中辛酸峰的拖尾因子应在 0.95~1.20之间。
[0039] 所述的专属性:空白溶液应没有其他峰干扰测定，标准品溶液与供试品溶液中辛 酸峰的保留时间的RSD不大于2%。
[0040] 所述的线性:r不低于0.99。
[0041] 所述的定量限：辛酸峰信噪比的平均值应不小于10。
[0042] 所述的精密度:重复性:精度度溶液中辛酸钠含量的RSD应不大于5%，中间精密度： 两个分析人员的RSD应不大于5%。
[0043] 所述的准确度:准确度溶液与精密度溶液中辛酸钠含量的RSD应不大于5%。
[0044]所述的耐用性:流速变化±25%系统适用性应符合上述标准要求。
[0045]与现有技术相比，本发明的有益效果为。
[0046] 1.三氯甲烷对人体及环境都有危害，本发明不需要将三氯甲烷挥发干，操作时间 短。增加了实验效率。
[0047] 2.样品的终体积是IOOyL，容易引起偏差，本发明有机相体积为1.0 mL，操作偏差 小。
【具体实施方式】
[0048] 以下通过实施例详细说明发明的内容，这些实施例并非是对本发明的限制。
[0049] 1.进样顺序： 空白溶液(1针） 内标溶液(1针） 标准品溶液(6针） 线性溶液(各1针） 定量限溶液(6针） 精密度溶液(各1针） 准确度溶液(各1针） 流速变化（± 25%)后进样顺序:标准品溶液(6针）。
[0050] 2.系统适用性验证。
[0051]目的：确认色谱条件符合系统适用性要求，能够满足检测需要。
[0052]方法：以6针标准品溶液进行系统适用性验证，计算辛酸峰与庚酸峰的分离度、辛 酸峰与庚酸峰面积之比及RSD值，及辛酸峰的拖尾因子。
[0053] 可接受标准。
[0054] A.辛酸峰与庚酸峰的分离度均应大于1.5。
[0055] B.辛酸峰与庚酸峰面积之比的RSD应不大于5 %。
[0056] C.辛酸峰的拖尾因子应在0.95~1.20之间。
[0057] 3.专属性验证。
[0058] 目的：确认在杂质(庚酸)存在下，本方法能够正确测定出被测物辛酸。
[0059] 方法。
[0060] A.通过1针空白溶液确定其他杂质对辛酸测定无干扰。
[0061] B.通过1针内标溶液确定庚酸峰保留时间。
[0062] C.标准品溶液6针，分别计算庚酸峰保留时间和辛酸峰保留时间。
[0063] D.供试品溶液(精密度溶液)6份各1针，分别计算庚酸峰保留时间和辛酸峰保留 时间。
[0064] E.计算标准品溶液和供试品溶液辛酸峰保留时间的RSD值。
[0065] 可接受标准。
[0066] A.空白溶液应没有其他峰干扰测定。
[0067] B.辛酸峰的保留时间的RSD不大于2%。
[0068] 4.线性验证。
[0069] 目的：确认在设计范围内，辛酸峰与庚酸峰面积比与样品中被测物辛酸的浓度直 接呈正比关系的程度。
[0070] 方法：以5种浓度的线性溶液的辛酸峰与庚酸峰面积比对辛酸浓度(mg/mL)作直线 回归，求得直线回归方程。
[0071] 可接受标准。
[0072] 直线回归相关系数(r)应不低于0.99。
[0073] 5 ·定量限验证。
[0074] 目的：确认样品中的被测物能够被定量测定的最低量。
[0075] 方法:取定量限溶液（线性验证中的最低浓度0.6 mg/mL溶液再稀释10倍)6份各1 针连续进样，计算辛酸峰的信噪比。
[0076]可接受标准:连续6针定量限溶液的辛酸峰信噪比平均值不小于10。
[0077] 6.精密度验证。
[0078]目的：通过重复性验证和中间精密度验证，确认在选定的测试条件下，对同一均匀 供试品溶液多次测定所得结果之间的接近程度。
[0079]方法。
[0080] A ·重复性验证。
[0081]在相同条件下，由同一个分析人员对6份精密度溶液(供试品溶液)各1针连续进 样，计算出辛酸钠含量，并计算辛酸钠含量RSD。
[0082] B.中间精密度验证。
[0083]在同一个实验室，在不同的时间，由另一个分析人员对6份精密度溶液(供试品溶 液)各1针连续进样，计算辛酸钠含量，并计算两个分析人员测定结果的RSD。
[0084] 可接受标准。
[0085] 重复性验证:辛酸钠含量RSD应不大于5%。
[0086]中间精密度验证:两个分析人员测定结果的RSD应不大于5%。
[0087] 7 ·准确度验证。
[0088] 目的：确认用本方法测定的结果与真实值接近的程度。 方法:分别对6针精密度溶液(100%溶液）、两种准确度溶液(120%溶液和80%溶液)各3针 进行辛酸峰与庚酸峰面积之比计算，计算辛酸钠含量，并计算辛酸钠含量的RSD。
[0089] 可接受标准:辛酸钠含量RSD应不大于5%。
[0090] 8 ·耐用性验证。
[0091 ]目的：确认在流速变化± 25%时，系统适用性结果不受影响。
[0092]方法。
[0093] A.将流速调整为2.5mL/min(+25%)，进6针标准品溶液，计算辛酸峰与庚酸峰的分 离度、辛酸峰与庚酸峰面积之比及辛酸峰的拖尾因子。
[0094] B.将流速调整为1.5mL/min( -25%)，进6针标准品溶液，计算辛酸峰与庚酸峰的 分离度、辛酸峰与庚酸峰面积之比及辛酸峰的拖尾因子。
[0095] 可接受标准。
[0096]系统适用性符合下列要求。
[0097] A.辛酸峰与庚酸峰的分离度应大于1.5。
[0098] B.辛酸峰与庚酸峰面积之比RSD应不大于5%。
[0099] C.辛酸峰的拖尾因子应在0.95~1.20之间。
[0100]总结:本发明给出的该方法可以准确的检测人血白蛋白中辛酸钠的含量，减少了 实验偏差和环境污染，提1? 了实验效率D
【主权项】
1.一种简便的GC法测定人血白蛋白中辛酸钢含量的方法，其特征在于:采用Ξ氯甲烧 制备样品时简便，系统适用性，专属性，定量限，线性，准确度，精密度，耐用性，符合《中国药 典》药品质量标准分析方法验证指导原则和《药品GMP指南?质量控制实验室与物料系统》 的要求，该测定方法如下： 取人血白蛋白一批次1瓶，作为方法验证供试品； 溶液配制： 1.5mol/L高氯酸溶液:取高氯酸12.2 mL，加超纯水定容至100 mL; 正庚酸溶液:精密称定0.2 g，用Ξ氯甲烧定容至10 mL，浓度为20 mg/血； 正辛酸溶液:精密称定0.5 g，用Ξ氯甲烧定容至10 mL，浓度为50 mg/血； 线性溶液:分别量取正辛酸溶液120 yL、300 yL、500 yL、700 yL、900 yL，各加入正庚 酸溶液1.0 mL，分别用Ξ氯甲烧定容至10 mL，辛酸线性浓度为0.6 mg/mL、1.5 mg/mL、2.5 mg/mL、3.5 mg/mL、4.5 mg/ni; 定量限溶液:取辛酸线性浓度为0.6 mg/血溶液1.0血，用Ξ氯甲烧定容至10血； 标准品溶液:取辛酸线性浓度为3.5 mg/mL溶液作为标准品溶液； 内标溶液:取正庚酸溶液2.5 mL，用Ξ氯甲烧定容至25 mL; 精密度溶液:量取人血白蛋白500化加水500化，加1.5 mol/L高氯酸溶液400化，振 荡混匀2分钟，加1.0 mL内标溶液，振荡混匀2分钟，W3000转/分钟，离屯、20分钟； 平行制备6份，取下层有机溶液进样； 准确度溶液:分别量取人血白蛋白600化加水400化（120%溶液）、400化加水600化 (80%溶液），混匀，各加1.5 mol/L高氯酸溶液400化，振荡混匀2分钟，各加1.0 mL内标溶 液，振荡混匀2分钟，W3000转/分钟，离屯、20分钟，分别平行制备3份，取下层有机溶液进样； 供试品溶液:精密度溶液作为供试品溶液； 空白溶液:取Ξ氯甲烧作为空白溶液； 试验条件(仪器参数）： 色谱柱：DB-FFAP(123-3232),0.32 mm*30 m， FID： 230 °C, 进样口 ：230°C， 炉溫：160 °C， 载气:氮气， 流速:2.0血/min, 进样量:0.1化， 运行时间：10分钟； 结果计算： 标准品溶液中辛酸峰与庚酸峰的分离度均应大于1.5,辛酸峰与庚酸峰面积之比的RSD 应不大于5 %，W线性溶液中辛酸峰与庚酸峰面积比对辛酸浓度(mg/mL)作直线回归，求得 直线回归方程，直线回归相关系数应不低于0.99,计算出供试品溶液中辛酸的浓度(mg/ mL)，结果计算中除辛酸峰与庚酸峰W外，其他的峰可忽略不计，再按下式计算供试品中辛 酸钢含量， 辛酸钢含量(mmol/g蛋白质）：式中:A为供试品溶液中辛酸的浓度，mg/mM η为供试品溶液的稀释倍数(1/供试品的取用量，队hL计算）； 144.22为辛酸分子量(1 mmol辛酸相当于1 mmol辛酸钢）； C为供试品蛋白质含量，g/mL。2. 按照权利要求1所述一种简便的GC法测定人血白蛋白中辛酸钢含量的方法，其特征 在于:Ξ氯甲烧制备样品时不需要将Ξ氯甲烧挥发至干。3. 按照权利要求1所述一种简便的GC法测定人血白蛋白中辛酸钢含量的方法，其特征 在于:所述的系统适用性:标准品溶液中辛酸峰与庚酸峰的分离度均应大于1.5,标准品溶 液中辛酸峰与庚酸峰面积之比的RSD应不大于5 %，标准品溶液中辛酸峰的拖尾因子应在 0.95~1.20之间。4. 按照权利要求1所述一种简便的GC法测定人血白蛋白中辛酸钢含量的方法，其特征 在于:所述的专属性:空白溶液没有其他峰干扰测定，标准品溶液与供试品溶液中辛酸峰的 保留时间的RSD不大于2〇/〇。5. 按照权利要求1所述一种简便的GC法测定人血白蛋白中辛酸钢含量的方法，其特征 在于:所述的线性:r不低于0.99。6. 按照权利要求1所述一种简便的GC法测定人血白蛋白中辛酸钢含量的方法，其特征 在于:所述的定量限：辛酸峰信噪比的平均值应不小于10。7. 按照权利要求1所述一种简便的GC法测定人血白蛋白中辛酸钢含量的方法，其特征 在于:所述的精密度和重复性:精度度溶液中辛酸钢含量的RSD应不大于5%，中间精密度:两 个分析人员的RSD应不大于5%。8. 按照权利要求1所述一种简便的GC法测定人血白蛋白中辛酸钢含量的方法，其特征 在于:所述的准确度:准确度溶液与精密度溶液中辛酸钢含量的RSD应不大于5%。9. 按照权利要求1所述一种简便的GC法测定人血白蛋白中辛酸钢含量的方法，其特征 在于:所述的耐用性:流速变化± 25%系统适用性应符合上述标准要求。
【文档编号】G01N30/02GK105842352SQ201610157446
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年3月18日
【发明人】杨健
【申请人】辽宁成大生物股份有限公司