一种白酒中吡嗪类化合物的高效液相色谱检测方法
【专利摘要】一种白酒中吡嗪类化合物的高效液相色谱检测方法，采用高效液相色谱?荧光检测器(HPLC?FLD)法对白酒中的吡嗪类化合物进行定性和定量分析，能够同时测定白酒中的2?甲基吡嗪、2,3?二甲基吡嗪、2,5?二甲基吡嗪、2,6?二甲基吡嗪、2,3,5?三甲基吡嗪、2?乙基?6?甲基吡嗪、2,3,5,6?四甲基吡嗪、2,3?二甲基?5?乙基吡嗪8种吡嗪类化合物。该方法不需要经过化学衍生，也不需手性柱或添加手性试剂就可分离吡嗪3种同分异构体，方法灵敏度高，准确度和重复性好，操作简单，成本低廉。
【专利说明】
一种白酒中吡嗪类化合物的高效液相色谱检测方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种白酒中吡嗪类化合物的高效液相色谱检测方法，属于白酒检测技 术领域。
【背景技术】
[0002] 吡嗪是一种1，4位含氮类的六元杂环化合物，它的衍生物广泛存在于天然和发酵 食品中。近年来对白酒中风味物质的研究发现虽然吡嗪类化合物在白酒中的含量甚微，但 其具有风味阈值低，香气透散性好，并对其它香味物质有明显的烘托叠加作用等特点，对白 酒的风味起着重要的作用。白酒中的四甲基吡嗪（川芎嗪）由美拉德反应生成，在制曲和堆 积发酵的过程中产生，经蒸馏带入酒中，具有扩张血管、改善微循环及抑制雪小板集聚等作 用，赋予中国白酒健康功能。所以对白酒中吡嗪类化合物的分析检测显得尤为重要。
[0003] 目前国内外对吡嗪类化合物的分离方法主要有液液萃取，真空浓缩后液液萃取， 固相萃取，离子交换和超临界萃取等。研究结果主要有王莉等人建立了一种利用气相色谱-质谱-离子扫描联用(GC/MS-SHO技术，该方法只定量分析了白酒中4种重要化合物;张艳红 等人采用SPME与GC/FTD相结合的方法，定量了8种吡嗪类化合物;李建飞等人建立了 SPME-GC-MS-SIM联用检测白酒中含氮类化合物。然而，以上方法需要大量的有机试剂，样品用量 大，且步骤过于繁琐，预处理过程中被分析物损失较大，对于白酒中吡嗪的高效液相色谱-荧光检测器的检测方法，未见报道。
[0004] 因此，建立一种操作简单，准确性高和重复性能够得到保证的检测白酒中8种吡嗪 类化合物的方法，有重要的现实意义。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于，提供一种白酒中吡嗪类化合物的高效液相色谱检测方法，即 建立高效液相色谱-荧光检测器分析中国白酒中吡嗪类化合物的方法，用于我国白酒中吡 嗪类化合物的分析，本发明方法能够同时测定白酒中8种吡嗪类化合物，不需要衍生化、对 吡嗪同分异构体的分离不需要使用手性柱或手性添加剂，方法前处理简单，灵敏度高，重复 性好。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案实现：
[0007] -种白酒中吡嗪类化合物的高效液相色谱检测方法，包括下述步骤：
[0008] 色谱条件:色谱柱：苯基柱Gemini 5μ〇6 - Phenyl IlOA 250mmX4.6mm;流动相由 流动相A和流动相B组合进行梯度洗脱，流动相A: pH= 1.8~2.3的含磷酸水溶液;流动相B: 乙腈;流速：1.0 mL/min;柱温：30°C ;进样量：IOyL;
[0009] 焚光检测器条件：Ex = 280nm，Em = 348nm;
[0010] 对照溶液的配制：分别精确称取2-甲基吡嗪、2,5_二甲基吡嗪、2,6_二甲基吡嗪、 2,3_二甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、2,3，5_三甲基吡嗪、2,3,5，6_四甲基吡嗪、2,3_二甲 基-5-乙基吡嗪对照品，用乙醇溶解定容，得标准储备液；
[0011] 供试品溶液的制备：取酒样于具塞离心管中，调pH为14,加 NaCl将其饱和，乙醚振 荡萃取，收集乙醚层，水浴挥至适量，水定容，过〇. 45μπι滤膜，HPLC-FLD进样分析；
[0012] 用外标法定量计算2-甲基啦嗪、2,3_二甲基吡嗪、2,5_二甲基啦嗪、2,6_二甲基吡 嗪、2,3，5_三甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、2,3，5，6_四甲基吡嗪、2,3-二甲基-5-乙基吡 嗪8种吡嗪化合物的浓度。
[0013] 具体地说，前述的白酒中吡嗪类化合物的高效液相色谱检测方法，包括下述步骤：
[0014] 色谱条件:色谱柱：苯基柱Gemini 5yC6 - Phenyl IlOA 250mmX4.6mm;流动相由 流动相A和流动相B组成，流动相A: pH= 1.8~2.3的含磷酸水溶液;流动相B:乙腈;梯度洗脱 流动相设置:按体积计算，Omin:含流动相A 95%，流动相B 5 % ; 6min:流动相A 95%，流动 相B 5% ;6. Imin:流动相A 1%，流动相B 99%; 12min:流动相A 1%，流动相B 99%; 12. Imin:流动相A 83%，流动B 17%; 12. Imin:流动相A 83%，流动B 17%; 12. Imin:流动 相A 83%，流动B 17%; 16min:流动相A 83%，流动B 17%; 16. Imin:流动相A 95%，流动B 5%;25min:流动相A 95%，流动B 5%;流速：1.0mL/min;柱温:30°C;进样量：10yL;
[0015] 焚光检测器条件：Ex = 280nm，Em = 348nm;
[0016] 对照溶液的配制：分别精确称取2-甲基吡嗪、2,5_二甲基吡嗪、2,6_二甲基吡嗪、 2,3_二甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、2,3，5_三甲基吡嗪、2,3,5，6_四甲基吡嗪、2,3_二甲 基-5-乙基吡嗪对照品各100± 10mg，用乙醇溶解定容，得10mg/mL标准储备液，储存于4°C冰 箱中；
[0017] 供试品溶液的制备:取酒样于具塞离心管中，用NaOH溶液调pH为12，再用NaOH溶液 调pH为14，加 NaCl将其饱和，乙醚振荡萃取，收集乙醚层，水浴挥至适量，水定容，过0.45μπι 滤膜-HPLC-FLD进样分析；
[0018] 用外标法定量计算2-甲基吡嗪、2,3_二甲基吡嗪、2,5_二甲基吡嗪、2,6_二甲基吡 嗪、2,3，5_三甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、2,3，5，6_四甲基吡嗪、2,3-二甲基-5-乙基吡 嗪8种吡嗪化合物的浓度。
[0019] 更具体地说，前述的白酒中吡嗪类化合物的高效液相色谱检测方法，包括下述步 骤：
[0020] 色谱条件：色谱柱：苯基柱Gemini 5yC6 - Phenyl IlOA 250mmX4.6mm;流动相由 流动相A和流动相B组成，流动相A: pH= 1.9~2.2的含磷酸水溶液;流动相B:乙腈;梯度洗脱 流动相设置:按体积计算，Omin:含流动相A 95%，流动相B 5 % ; 6min:流动相A 95%，流动 相B 5% ;6. Imin:流动相A 1%，流动相B 99%; 12min:流动相A 1%，流动相B 99%; 12. Imin:流动相A 83%，流动B 17%; 12. Imin:流动相A 83%，流动B 17%; 12. Imin:流动 相A 83%，流动B 17%; 16min:流动相A 83%，流动B 17%; 16. Imin:流动相A 95%，流动B 5%;25min:流动相A 95%，流动B 5%;流速：1.0mL/min;柱温:30°C;进样量：10yL;
[0021 ]焚光检测器条件：Ex = 280nm，Em = 348nm;
[0022] 对照溶液的配制：分别精确称取2-甲基吡嗪、2,5_二甲基吡嗪、2,6_二甲基吡嗪、 2,3_二甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、2,3，5_三甲基吡嗪、2,3,5，6_四甲基吡嗪、2,3_二甲 基-5-乙基吡嗪对照品各100± 10mg，用乙醇溶解定容，得10mg/mL标准储备液，储存于4°C冰 箱中；
[0023] 供试品溶液的制备：取酒样IOmL于具塞50mL离心管中，用12moI/LNaOH调pH为12， 再用lmol/L NaOH调pH为14，加 NaCl将其饱和，15mL乙醚振荡萃取15min，重复提取2次，收集 乙醚层，70 °C水浴挥至约0.5ml，水定容ImL，过0.45μπι滤膜-HPLC-FLD进样分析；
[0024]用外标法定量计算2-甲基吡嗪、2,3_二甲基吡嗪、2,5_二甲基吡嗪、2,6_二甲基吡 嗪、2,3，5_三甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、2,3，5，6_四甲基吡嗪、2,3-二甲基-5-乙基吡 嗪8种吡嗪化合物的浓度。
[0025]前述的白酒中吡嗪类化合物的高效液相色谱检测方法中，所述的流动相A的含磷 酸水溶液的PH=2.1。
[0026] 前述的白酒中吡嗪类化合物的高效液相色谱检测方法中，所述对照溶液这样配 制：分别精确称取2-甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2，6_二甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2-乙 基-6-甲基吡嗪、2，3，5-三甲基吡嗪、2，3，5，6-四甲基吡嗪、2，3-二甲基-5-乙基吡嗪对照品 各IOOmg，用乙醇溶解定容，得10mg/mL标准储备液，储存于4°C冰箱中，用纯水稀释为质量浓 度从低到高依次为0 · lyg/mL、0 · 2yg/mL、0 · 5yg/mL、1 · Oyg/mL、2 · Oyg/mL、5 · Oyg/mL的吡嗪类 混合对照品溶液，测定峰面积，以质量浓度为横坐标、峰面积为纵坐标，绘制标准溶液的工 作曲线；
[0027] 前述的白酒中吡嗪类化合物的高效液相色谱检测方法中，所述检测方法按下式用 外标法定量计算8种啦嗪化合物的浓度。
[0028]
[0029]式中：
[0030] X--试样中吡嗪的含量，单位为mg/L
[0031 ] c--由标准曲线查得试样进样液中吡嗪的浓度，单位为微克每毫升(yg/mL); [0032] Co--由标准曲线查得空白试样进样液中吡嗪的浓度，单位为微克每毫升(yg/ mL)；
[0033] Vi--试样定容体积，单位为毫升(mL);
[0034] V--取样量，单位为_升(mL)
[0035]结果保留2为有效数字。
[0036] 前述的白酒中吡嗪类化合物的高效液相色谱检测方法中，所述的白酒的酒精浓度 为38~53度。
[0037] 前述的白酒中吡嗪类化合物的高效液相色谱检测方法中，所述的白酒为：以曲类、 酒母为糖化发酵剂，利用淀粉质原料，经蒸煮、糖化、发酵、蒸馏、陈酿和勾兑而酿制而成的 各类酒。
[0038] 前述的白酒中吡嗪类化合物的高效液相色谱检测方法，所述的白酒中8种吡嗪类 化合物为:2_甲基吡嗪、2,3_二甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基 吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、2,3,5,6_四甲基吡嗪和2,3_二甲基-5-乙基吡嗪。
[0039] 前述的白酒中吡嗪类化合物的高效液相色谱检测方法，所述的白酒为：中国特有 的一种蒸馏酒，以曲类、酒母为糖化发酵剂，利用淀粉质原料，经蒸煮、糖化、发酵、蒸馏、陈 酿和勾兑而酿制而成的各类酒。
[0040] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0041] (1)方法灵敏度高，准确度和重复性好，操作简单，成本低廉。
[0042] (2)能够同时测定白酒中8种吡嗪类化合物，不需要衍生化、对吡嗪同分异构体的 分离不需要使用手性柱或手性添加剂。
[0043] 发明人采用高效液相色谱检测方法-荧光检测器(HPLC-FLD)法对白酒中吡嗪类物 质的测定，进行了大量的实验，具体如下：
[0044] 1.1仪器与试剂
[0045]高效液相色谱仪(Aglient-1260,美国安捷伦公司），配有DAD光电二极管阵列检测 器和FLD荧光检测器;超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司）；氮吹仪(TurboVap LV);旋 转蒸发仪(EYELANYC-2100) ;Milli-Q Academic超纯水系统(密理博中国有限公司）；恒温水 浴锅:振荡混勾器(Multi Reax，德国Heidolph公司）。
[0046] 吡嗪标准品：2-甲基吡嗪U 99 % )、2，5-二甲基吡嗪U 98 % )、2，6-二甲基吡嗪 (98%)、2,3-二甲基吡嗪（99%)、2-乙基-6-甲基吡嗪（95%)、2,3,5-三甲基吡嗪（2 99%)、 2,3,5,6_四甲基吡嗪98%)，均购于上海安谱科学仪器有限公司；2,3_二甲基-5-乙基吡 嗪，购于山东省滕州市华东生物科技有限公司。
[0047]甲醇(分析纯及色谱纯）；乙腈(分析纯及色谱纯）；甲酸(色谱纯），以上试剂均购置 MERCK公司；磷酸（色谱级、纯度2 99.9% )，购于天津市光复精细化工研究所;无水乙醇、乙 醚(色谱级、纯度2 99.5 % )，购于天津市科密欧化学试剂有限公司；
[0048] 1.2实验操作
[0049] 1.2.1前处理方法
[0050] 取IOmL白酒，加入 12mol/L NaOH调pH为 12,再用lmol/L NaOH调pH为 14。加 NaCl将 其饱和，用15mL乙醚振荡萃取15min，重复提取2次，收集乙醚层，无水硫酸钠干燥;置70°C水 浴挥至约0.5ml，水定容ImL，过0.45μηι滤膜，供高效液相色谱分析。
[0051 ] 1 · 2 · 2HPLC 色谱条件
[0052]流动相Α:含磷酸水溶液(ρΗ = 2.1);流动相Β:乙腈;梯度洗脱流动相设置:按体积 计算，Omin:含流动相A 95%，流动相B 5% ;6min:流动相A 95%，流动相B 5%;6. Imin:流 动相A 1%，流动相B 99%; 12min:流动相A 1%，流动相B 99%; 12. Imin:流动相A 83%，流 动B 17%; 12. Imin:流动相A 83%，流动B 17%; 12. Imin:流动相A 83%，流动B 17%; 16min:流动相A 83%，流动B 17%; 16 .Imin:流动相A 95%，流动B 5%; 25min:流动相A 95%，流动 B 5%;色谱柱：苯基柱 Gemini 5yC6 -Phenyl 110A，250mmX4.6mm;柱流速： I .OmL/min;柱温：30°C ;进样量：IOyL;焚光检测器条件:Ex = 280nm，Em = 348nm。
[0053]用8种吡嗪类化合物标准品混合溶液，建立浓度范围为0.5~5yg/mL的8种吡嗪类 化合物标准品的浓度和高效液相色谱峰峰面积的校正曲线，与HPLC所测的样品中8中吡嗪 的峰面积进行比较，用外标法定量计算出对应的8种吡嗪的浓度，再换算成原取酒样中8种 吡嗪的浓度。
[0054] 2结果与讨论
[0055] 2.1吡嗪类物质的选择
[0056] 本研究选用典型的白酒的代表酒样8个，采用酸化液液萃取、调碱、再萃取，最后真 空浓缩的样品前处理方法，对8个酒样中的吡嗪类化合物进行的提取，采用GC-MS全扫描的 方式进行吡嗪类化合物的粗筛，以确定白酒中含量高的吡嗪化合物。通过对峰面积大小的 比较，发现8个典型酒样有吡嗪类物质的含量具有一定的共性，其中每种酒样检测到的吡嗪 类化合物种类不等，约有19-25种，但是含量高的前五种吡嗪化合物均是2，3，5-三甲基吡 嗪、2，3,5，6_四甲基吡嗪、2,3_二甲基-5-乙基吡嗪、2-乙基-6甲基吡嗪和2,6_二甲基吡嗪， 虽然这五种吡嗪在8个酒样中含量高低排列顺序不完全一致，但是他们都排在前五位，且按 峰面积计算含量约占总量的73.97 %~90.0 O %之间。同时还发现8个酒样中含量较高的前 九种吡嗪也基本相似，且按面积计算含量约占总量的86.61 %~95.50%之间。含量高的前 9种吡嗪化合物为：2，3，5-三甲基吡嗪、2，3，5，6-四甲基吡嗪、2，3-二甲基-5-乙基吡嗪、2-乙基-6甲基吡嗪、2，6-二甲基吡嗪、2，3-二甲基吡嗪、2，5-二甲基吡嗪、2-甲基吡嗪和2，3， 5-三甲基-6-乙基吡嗪。能买到标准品的有2，3，5-三甲基吡嗪、2，3，5，6-四甲基吡嗪、2，3-二甲基-5-乙基吡嗪、2-乙基-6甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2，3_二甲基吡嗪、2,5-二甲基吡 嗪和2-甲基吡嗪这8种物质。2,3,5_三甲基-6-乙基吡嗪无法购买到标准品，且考虑该物质 在这8种酒样中的含量排序都不在前五位，因此以能买到标准品的8种吡嗪化合物作为测定 白酒中吡嗪类化合物的目标物质。即2,3,5_三甲基吡嗪、2,3,5,6_四甲基吡嗪、2,3_二甲 基-5-乙基吡嗪、2-乙基-6甲基吡嗪、2，6_二甲基吡嗪、2,3-二甲吡嗪、2,5-二甲基吡嗪和2-甲基吡嗪。8种酒样的全扫描峰面积初步定量结果见表1，按峰面积计算含量大概在83.2% ~93.9%左右。
[0057] 表1 8种酒样气质全扫描含量
[0059] 2.2液相色谱柱的选择
[0060] 首先选择了常用的C18色谱柱为分析柱，使用了菲罗门、安捷伦、热电等不同型号的 C18、C8柱，因为分析的8种吡嗪类化合物均为烷基取代化合物，其中2，3-二甲基吡嗪，2，5-二 甲基吡嗪，2,6_二甲基吡嗪为同分异构体，在C 18柱上的保留时间非常接近，如图1;考虑到吡 嗪类化合物属于芳杂环，烷基吡嗪的极性降低，亲脂性增强<X 18、C8柱常因硅醇基效应而保 留时间延长以及产生包裹及峰拖尾现象，研究者尝试了在流动相中添加手性添加剂、调节 流动相PH值、改变流动相极性等方法均不能分离以上3种同分异构体，而若采用手性柱则过 于昂贵(约4万RMB每根），不利于方法的推广。在咨询了其他色谱柱生产厂商，最终采用菲罗 门苯基柱Gemini 5yC6 -Phenyl IlOA 250mmX4.6mm，在甲醇：水(5:95)等度条件下得到 的分离效果图说明8种吡嗪均有保留，但分离效果需进一步改进，如图2。
[0061] 2.3液相检测器的选择
[0062] 本研究首先采用DAD检测器，在波长275nm处测试8种吡嗪类化合物的对照品溶液 均能得到较好的响应和较低的检出限，但在测试样品过程中，发现在2,3,5_三甲基吡嗪和 2，3-二甲基吡嗪的中间有一个很大的干扰峰，且这个干扰峰能覆盖掉2，3，5-三甲基吡嗪， 如图3。分析这主要是由于紫外检测器选择性较差，且白酒中含有大量的醇类、酯类、酚类等 物质，这些物质大多都有紫外吸收，因此干扰了 2，3，5-三甲基吡嗪和2，3-二甲基吡嗪的出 峰。本研究尝试了更换流动相条件和改变前处理方法均等手段均无法有效去除这个干扰 峰。在更换FLD检测器测试样品后，发现在2,3,5_三甲基吡嗪和2,3_二甲基吡嗪的峰中间干 扰峰依然存在，但其响应比DAD检测器的信号降低了几个数量级，且能与2,3,5_三甲基吡嗪 和2，3-二甲基吡嗪完全分离，如图4;对比DAD检测器和FLD检测器，在分离吡嗪标液的时候 均性能良好，在测试相同浓度的对照品溶液时，FLD检测器和DAD检测器的响应并无优劣之 分。但在分析样品的时候，DAD检测器在2，3，5-三甲基吡嗪和2，3-二甲基吡嗪的峰中间有很 大的干扰峰，通过前处理无法去掉，在改用FLD检测器后该干扰峰变低且能与2，3，5-三甲基 吡嗪和2,3-二甲基吡嗪完全分离。所以最终确定采用FLD检测器，激发波长Ex: 280nm，发射 波长 Em: 348nm。
[0063] 2.4液相流动相的选择
[0064] 为得到简单易得，分离度高，分析时间短的流动相系统，本发明方法分别对甲醇+ 水、甲醇+缓冲盐（乙酸铵）、乙腈+水、乙腈+缓冲盐（乙酸铵）、甲醇+手性添加剂W环糊精）、 乙腈+手性添加剂ω环糊精)等不同的流动相系统进行了多次摸索，发现吡嗪类物质在甲醇 +水和甲醇+缓冲盐系统中的出峰时间较晚，且结构相似的吡嗪类化合物不能分离，在加入 缓冲盐后分离度不但没有改善，峰之间会形成包裹，峰形也会拖尾;如图5。乙腈+水系统的 出峰时间较甲醇系统的提前，峰形也较好，但单纯的乙腈水系统并不能使8种吡嗪完全分 离，需进一步完善分离效果。如图6。乙腈+缓冲盐系统也没能有效改善分离度，反而使峰形 变差。甲醇祁环糊精系统、乙腈+β环糊精系统虽然都能部分吡嗪类物质能得到良好的峰形 和分离效果，但却不能使2,3-二甲基吡嗪、2，5_二甲基吡嗪2，6_二甲基吡嗪三种吡嗪同分 异构体完全分离，如图7为8种吡嗪在乙腈祁环糊精系统中的分离图。考虑到在以上的流动 相系统中，只有乙腈+水系统最接近完全分离，因此决定采用乙腈+水系统作为流动相，在此 基础上进一步优化分离条件。
[0065] 2.5流动相pH值得确定
[0066]本发明方法发现在用液相色谱柱进行吡嗪类化合物的分离时，发现吡嗪类化合物 对流动相的pH值很敏感，pH值有细微差异，分离效果就会有明显差异。在乙腈+水的流动相 系统中，加入磷酸调流动相pH值，不同的pH值条件下，吡嗪类物质的出峰时间会出现变化， 出峰时间会随着流动相pH值的降低而提前。在流动相pH= 1.9时，8种吡嗪类物质整体出峰 时间提前，2-甲基吡嗪与2，3,5_三甲基吡嗪、2，3_二甲基吡嗪与2,6_二甲基吡嗪不能分离， 如图8;在流动相pH= 2.0时，2，3，5-三甲基吡嗪、2，3-二甲基吡嗪和2，6-二甲基吡嗪和三种 物质不能分离，如图9。在流动相pH = 2.1时，8种吡嗪类物质均能得到良好的分离度，如图 10。在流动相PH= 2.2时，出现2，3，5-三甲基吡嗪、2，3-二甲基吡嗪和2，5-二甲基吡嗪和三 种物质不能分离，且2,5_二甲基吡嗪和2,6_二甲基吡嗪两种物质的出峰时间完全重合，各 种物质出峰时间都相应推迟，不仅没有改善分离度，反而增加了分析时间，如图11。因此，本 发明方法采用pH=2.1时流动相系统，能得到相对较好的分离条件；
[0067]本发明方法在尝试了多种流动相梯度后，为保证较短的分析时间的得到良好峰 形，最终确定的流动相梯度:流动相A:含磷酸水溶液(pH=2.1);流动相B:乙腈;梯度洗脱流 动相设置:按体积计算，Omin:含流动相A 95 %，流动相B 5 % ; 6min:流动相A 95 %，流动相B 5% ;6. Imin:流动相A 1%，流动相B 99%; 12min:流动相A 1%，流动相B 99%; 12. Imin:流 动相A 83%，流动B 17%; 12. Imin:流动相A 83%，流动B 17%; 12. Imin:流动相A 83%，流 动13 17%;16111；[11:流动相八83%，流动13 17%;16.1111；[11:流动相八95%，流动13 5%;25111；[11: 流动相A 95%，流动B 5%;
[0068] 2.6前处理方法的选择
[0069]为建立回收率高，成本低，操作简单，重现性好的前处理方法，本发明方法试验大 量的前处理方法，以下为其中几种。
[0070] 方法一：取酒样IOOmL于旋蒸瓶中-50°C旋转至40mL左右-加水定容到50ml-取 lmL-过0 · 45μπι滤膜-HPLC-FLD进样分析。
[0071]该方法前处理简单，不用消耗试剂，样品和消耗量大，回收率低且不稳定，且2,3_ 二甲基-5-乙基吡嗪、2-乙基-6甲基吡嗪不能被有效提取。如图12为采用方法一分析某白酒 样品中8种吡嗪分离色谱图。
[0072] 方法二：取酒样IOmL于三角烧瓶中-用12mol/L HCl调pH为1-50°C旋转蒸发至 2mL左右-用5mL重蒸乙醚分别萃取3次，收集水层-用12mol/L NaOH调pH为7,再用lmol/L NaOH缓调pH为10-加 NaCl将其饱和-用5mL重蒸乙醚分别萃取3次，收集乙醚层-加2g无水 硫酸钠干燥-过滤-旋蒸浓缩至lmL-水定容至2mL-过0.45μπι滤膜-HPLC-FLD进样分析。
[0073] 该方法能去除掉样品中的酯、醇类杂质，能得到比较干净的色谱图，各物质峰型良 好，但该方法过程复杂，耗时长，回收率不高，如图13为采用方法二分析某白酒样品中8种吡 嗪分离色谱图。
[0074] 方法三：取酒样IOmL于具塞50mL离心管中-用12mol/LNa0H调pH为12,再用I mol/ LNaOH调pH为14-加NaCl将其饱和-15mL乙醚振荡萃取15min，重复提取2次，收集乙醚层- 70°C水浴挥至约0.5ml-水定容lmL-过0.45μπι滤膜-HPLC-FLD进样分析。
[0075]该方法前处理较为简单，且方法稳定性好，回收率高，8种吡嗪类物质分离度高，峰 型和信号响应良好，但该法样品挥干耗时较长，且要留意样品不能挥干，约剩〇.5ml左右即 可。如图14为采用方法三分析某白酒样品中8种吡嗪分离色谱图。
[0076]表2不同前处理方法优缺点的比较
[0078]由表2不同前处理方法优缺点的比较，选择方法三作为酒样前处理方法。
[0079] 2.6柱温和流速的选择
[0080] 以0.1%磷酸溶液-乙腈为流动相，固定流速l.OmL/min不变，在30、40、45、50、60°C 这5个柱温条件进行分析，发现柱温对各种吡嗪类化合物的影响并不明显，所以采用30°C柱 温。设置柱温30°C，以0.1 %磷酸溶液-乙腈为流动相，考察流速分别为0.5、0.8、1.0、1.2、 1.5mL/min时的分离情况，发现流速越低，分析时间延长，峰形变差;随着流速的升高，分析 时间明显缩短，但影响分离度，综合分离度和分析时间，因此，选择1.0mL/min的流速作为分 析流速。
[0081 ] 2.7影响HPLC分析的外界因素
[0082]用HPLC同时分离白酒中的8中吡嗪化合物时，需严格控制流动相得pH值，pH值得细 微变化会对分离效果造成显著影响；在对乙醚进行挥干浓缩的过程中，应严格控制水浴的 温度为70°C，超过70°C回收率明显降低。浓缩过程不能将乙醚挥干，应严格控制所剩体积在 0.5ml左右，挥干后回收率也会明显降低。
[0083] 2.8工作曲线和检测限
[0084] 将配制好的标准溶液按上述条件进样分析，得到8种吡嗪的线性方程见表3。在0.5 ~5yg/mL浓度范围内具有良好的线性关系，线性相关系数均在0.99以上，可满足准确定量 的要求。以S/N = 3确定检出限，其中2,3,5,6_四甲基吡嗪为0.10yg/mL、2-甲基吡嗪为0.05 yg/mL、2，3，5-三甲基吡嗪为O · 10yg/mL、2，3-二甲基吡嗪为O · 15yg/mL、2，5-二甲基吡嗪为 0.2448/1111^、2,6-二甲基吡嗪为0.1348/1]11^、2,3-二甲基-5-乙基吡嗪为0.1348/1]11^、2-乙基-6 甲基吡嗪为0.10yg/mL。图15为对照品含量为最低限0.5yg/mL时8种吡嗪类物质的色谱图， 表3为8种吡嗪的线性关系。
[0085] 表3 8种吡嗪化合物的线性方程
[0087] 2.9精密度考察
[0088]将2ug/ml的混标连续进样6次，根据所得峰面积分别计算精密度，2，3，5-三甲基吡 嗪、2,3，5，6_四甲基吡嗪、2,3-二甲基-5-乙基吡嗪、2-乙基-6甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、 2,3_二甲吡嗪、2，5_二甲基吡嗪和2-甲基吡嗪的RSD范围均在1.04%~2.49%之间，表明该 方法的精密度良好，结果见表4。
[0089]表4 8种吡嗪化合物的精密度实验
[0092] 2.10重复性考察
[0093] 精密称取同一份白酒样品6份，按1.2.1的方法进行前处理，按上述色谱条件进样 1(^1，测得2,3,5-三甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪、2,3-二甲基-5-乙基吡嗪、2-乙基-6甲 基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,3-二甲吡嗪、2,5-二甲基吡嗪和2-甲基吡嗪的平均含量在，RSD 分别为 2.54%、3.01%、4.22%、1.85%、2.13%、2.68%、3.79%、2.80%，结果表明该方法 的重复性均达到分析的要求。
[0094] 2.11回收率考察
[0095]用无水乙醇配置出53%乙醇，作为空白酒样，加入不同浓度的吡嗪标准品做加标 回收试验，根据白酒中八种吡嗪化合物含量的高低，其中2-甲基吡嗪、2，3-二甲基吡嗪、2， 5-二甲基吡嗪分别添加 0. lmg/kg、0.2mg/kg、0.5mg/kg三个不同水平质量浓度，另外五种[!比 嗪分别添加 0. 5mg/kg、lmg/kg、2mg/kg三个不同水平质量浓度，每个添加水平做6个平行样 品，表5数据表明该方法测定八种吡嗪化合物精密度和回收率良好。
[0096] 表5方法回收率和精密度(n = 6)
[0099] 3部分白酒中吡嗪类物质的含量
[0100] 我们用所建立的方法对这31个具有代表性酒样中的吡嗪化合物含量进行了测定， 定量结果见表6。
[0101] 表6部分白酒中吡嗪化合物的含量(mg/L)
Lmu4」 对31个秤中八柙PK嗪化甘物的总重进仃J排夕?，如表6所不。从这二卞个日酒 样测定数据我们可以看出，其中四甲基吡嗪在21个酒中含量排在第一位，在7个酒中含量排 在第二位，在3个酒中含量排在第三位;三甲基吡嗪在18个酒中含量排在第二位，在7个酒中 含量排在第一位，在6个酒中含量排在第三位;2,6_二甲基吡嗪在31个酒样中排在前三位的 占30个，这和我们最初用气质全扫描初步定量的结果是相吻合的，可以看出四甲基吡嗪和 三甲基吡嗪含量大约都在几个毫克每升，对于白酒中的吡嗪类物质来说含量算高的。
[0105] 4结论
[0106] 上述实验结果表明：白酒中吡嗪类化合物的高效液相色谱测定方法，利用吡嗪类 物质的荧光特性、特定的流动相系统和流动相梯度洗脱程序、一定的萃取浓缩过程等关键 技术，建立了带荧光检测器的高效液相色谱仪测定白酒中8种吡嗪类化合物含量的方法，色 谱条件如下：色谱柱为苯基柱Gemini 5μ〇6 - Phenyl IlOA 250mmX4.6mm;焚光检测器条 件:Ex = 280nm，Em = 348nm;流动相A:含磷酸水溶液(pH = 2 · I);流动相B:乙腈；采用梯度洗 脱程序。该方法对8种吡嗪类化合物的回收率为85.3%~102.2%，RSD为2.57%~4.11 %， 检出限为0.05~0.24yg/mL。说明该方法准确度、灵敏度、和重复性好，而且样品不需要化学 衍生，也不要手性柱或添加手性试剂就可分离3种吡嗪同分异构体，使用价格相对低廉的高 效液相色谱仪，操作简便。可望用于中国白酒中吡嗪类化合物的日常检测，如图16。
【附图说明】
[0107] 图1是在普通C18柱上2,3-二甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪和2,6-二甲基吡嗪三种同 分异构体的分离色谱图。
[0108] 图2是采用菲罗门苯基柱Gemini 5yC6 -Phenyl IlOA 250mmX4.6mm，在甲醇：水 作为流动相，等度条件下得到的8种吡嗪分离效图。
[0109] 图3是采用DAD检测器，在波长275nm处进行样品实测中，2，3，5-三甲基吡嗪和2，3-二甲基吡嗪的中间的干扰峰。
[0110] 图4是采用FLD检测器测试样品，在2,3,5_三甲基吡嗪和2,3_二甲基吡嗪的峰中间 干扰峰依然存在，但其响应比DAD检测器的信号降低了几个数量级，且能与2,3,5_三甲基吡 嗪和2,3-二甲基吡嗪完全分离。
[0111] 图5是甲醇+缓冲盐系统中的8种吡嗪的分离色谱图，结构相似的吡嗪类化合物不 能分离，峰之间会形成包裹，峰形也会拖尾。
[0112]图6是乙腈+水系统中的8种吡嗪的分离色谱图，部分吡嗪间分离度高，峰形良好， 但单纯的乙腈水系统并不能使8种吡嗪完全分离。
[0113]图7是为8种吡嗪在乙腈祁环糊精系统中的分离图，出峰时间较乙腈+水系统延迟， 峰之间有包裹，分离度不高。
[0114] 图8是采用乙腈:pH= 1.9的磷酸水溶液时的8种吡嗪分离色谱图。
[0115] 图9是采用乙腈:pH=2.0的磷酸水溶液时的8种吡嗪分离色谱图。
[0116] 图10是采用乙腈:pH=2.1的磷酸水溶液时的8种吡嗪分离色谱图。
[0117] 图11是采用乙腈:pH=2.2的磷酸水溶液时的8种吡嗪分离色谱图。
[0118] 图12是采用方法一分析某白酒样品中8种吡嗪分离色谱图。
[0119] 图13是为采用方法二分析某白酒样品中8种吡嗪分离色谱图。
[0120] 图14是为采用方法三分析某白酒样品中8种吡嗪分离色谱图。
[0121] 图15是为对照品含量为最低限0.5yg/mL时8种吡嗪类物质的分离色谱图。
[0122] 图16是采用FLD检测器时8种吡嗪化合物标准品的最佳分离色谱图。出峰顺序分别 为2,3,5,6_四甲基吡嗪、2-甲基吡嗪、2,3,5_三甲基吡嗪、2,3_二甲基吡嗪、2,6_二甲基吡 嗪、2，5_二甲基吡嗪，2，3_二甲基-5-乙基吡嗪、2-乙基-6甲基吡嗪。
【具体实施方式】
[0123] 实施例1:
[0124] 白酒中吡嗪类化合物的高效液相色谱检测方法，包括下述步骤：
[0125] 色谱条件:色谱柱：苯基柱Gemini 5yC6 - Phenyl IlOA 250mmX4.6mm;流动相由 流动相A和流动相B组成，流动相A:pH = 2.1的含磷酸水溶液;流动相B:乙腈;梯度洗脱流动 相设置:按体积计算，Omin:含流动相A 95 %，流动相B 5 % ; 6min:流动相A 95 %，流动相B 5% ;6. Imin:流动相A 1%，流动相B 99%; 12min:流动相A 1%，流动相B 99%; 12. Imin:流 动相A 83%，流动B 17%; 12. Imin:流动相A 83%，流动B 17%; 12. Imin:流动相A 83%，流 动13 17%;16111；[11:流动相八83%，流动13 17%;16.1111；[11:流动相八95%，流动13 5%;25111；[11: 流动相A 95%，流动B 5%;流速：1.0mL/min;柱温:30°C;进样量：10yL;
[0126]焚光检测器条件：Ex = 280nm，Em = 348nm;
[0127] 对照溶液的配制：分别精确称取2-甲基吡嗪、2，5-二甲基吡嗪、2，6-二甲基吡嗪、 2,3_二甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、2,3，5_三甲基吡嗪、2,3,5，6_四甲基吡嗪、2,3_二甲 基-5-乙基吡嗪对照品IOOmg，用乙醇溶解定容，得lOmg/mL标准储备液，储存于4°C冰箱中， 用纯水稀释为质量浓度从低到高依次为0 · lyg/mL、0 · 2yg/mL、0 · 5yg/mL、1.0yg/mL、2 · Oyg/ mL、5.0yg/mL的吡嗪类混合对照品溶液，测定峰面积，以质量浓度为横坐标、峰面积为纵坐 标，绘制标准溶液的工作曲线；
[0128] 供试品溶液的制备：取IOml白酒，置于50ml具塞离心管中，加入12moI/LnaOH溶液 调pH为12，再用lmol/L NaOH溶液调pH为14;加 NaCl将其饱和，15mL乙醚振荡萃取15min，重 复提取2次，收集乙醚层，无水硫酸钠干燥;70 °C水浴挥至约0.5ml，水定容ImL，过0.45μηι滤 膜，供高效液相色谱检测仪分析；
[0129] 用外标法定量计算2-甲基吡嗪、2,3_二甲基吡嗪、2,5_二甲基吡嗪、2,6_二甲基吡 嗪、2,3，5_三甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、2,3，5，6_四甲基吡嗪、2,3-二甲基-5-乙基吡 嗪8种吡嗪化合物的浓度。
【主权项】
1. 一种白酒中化嗦类化合物的高效液相色谱检测方法，其特征在于:包括下述步骤： 色谱条件:色谱柱:苯基柱Gemini扣Cs-陆en^ 110A 250mmX4.6mm;流动相由流动相 A和流动相B组合进行梯度洗脱，流动相A:pH= 1.8~2.3的含憐酸水溶液;流动相B:乙腊;流 速：1. OmL/min;柱溫：30 °C ;进样量：lOyL 巧光检测器条件:Ex = 280皿，血=348皿； 对照溶液的配制：分别精确称取2-甲基化嗦、2,5-二甲基化嗦、2,6-二甲基化嗦、2,3- 二甲基化嗦、2-乙基-6-甲基化嗦、2,3,5-S甲基化嗦、2,3,5,6-四甲基化嗦、2,3-二甲基- 5-乙基化嗦对照品，用乙醇溶解定容，得标准储备液； 供试品溶液的制备：取酒样于具塞离屯、管中，调pH为14,加 NaCl将其饱和，乙酸振荡萃 取，收集乙酸层，水浴挥至适量，水定容，过0.45WI1滤膜，HPLC-FLD进样分析； 用外标法定量计算2-甲基化嗦、2,3-二甲基化嗦、2,5-二甲基化嗦、2,6-二甲基化嗦、 2.3.5- S甲基化嗦、2-乙基-6-甲基化嗦、2,3,5,6-四甲基化嗦、2,3-二甲基-5-乙基化嗦8 种化嗦化合物的浓度。2. 如权利要求1所述的白酒中化嗦类化合物的高效液相色谱检测方法，其特征在于:包 括下述步骤： 色谱条件:色谱柱:苯基柱Gemini扣Cs-陆en^ 110A 250mmX4.6mm;流动相由流动相 A和流动相B组成，流动相A:抑=1.8~2.3的含憐酸水溶液;流动相B:乙腊;梯度洗脱流动相 设置：按体积计算，Omin:含流动相A 95%，流动相B 5%;6min:流动相A 95%，流动相B 5%;6.1min:流动相Al%，流动相B99%;12min:流动相Al%，流动相B99%;12.1min:流 动相A 83%，流动B 17%; 12. Imin:流动相A 83%，流动B 17%; 12. Imin:流动相A 83%，流 动B 17%;16min:流动相A 83%，流动B 17%;16.1min:流动相A 95%，流动B 5%;25min: 流动相A 95%，流动B 5%;流速:1.0mL/min;柱溫:30°C;进样量 巧光检测器条件:Ex = 280皿，血=348皿； 对照溶液的配制：分别精确称取2-甲基化嗦、2,5-二甲基化嗦、2,6-二甲基化嗦、2,3- 二甲基化嗦、2-乙基-6-甲基化嗦、2,3,5-S甲基化嗦、2,3,5,6-四甲基化嗦、2,3-二甲基- 5-乙基化嗦对照品各100 ± lOmg，用乙醇溶解定容，得lOmg/mL标准储备液，储存于4°C冰箱 中； 供试品溶液的制备:取酒样于具塞离屯、管中，用化0田容液调抑为12，再用化0田容液调抑 为14,加化C1将其饱和，乙酸振荡萃取，收集乙酸层，水浴挥至适量，水定容，过0.45WI1滤膜 一 HPLC-FLD进样分析； 用外标法定量计算2-甲基化嗦、2,3-二甲基化嗦、2,5-二甲基化嗦、2,6-二甲基化嗦、 2.3.5- S甲基化嗦、2-乙基-6-甲基化嗦、2,3,5,6-四甲基化嗦、2,3-二甲基-5-乙基化嗦8 种化嗦化合物的浓度。3. 如权利要求2所述的白酒中化嗦类化合物的高效液相色谱检测方法，其特征在于:包 括下述步骤： 色谱条件:色谱柱:苯基柱Gemini扣Cs-陆en^ 110A 250mmX4.6mm;流动相由流动相 A和流动相B组成，流动相A:抑=1.9~2.2的含憐酸水溶液;流动相B:乙腊;梯度洗脱流动相 设置：按体积计算，Omin:含流动相A 95%，流动相B 5%;6min:流动相A 95%，流动相B 5%;6.1min:流动相Al%，流动相B99%;12min:流动相Al%，流动相B99%;12.1min:流 动相A 83%，流动B 17%; 12. Imin:流动相A 83%，流动B 17%; 12. Imin:流动相A 83%，流 动B 17%;16min:流动相A 83%，流动B 17%;16.1min:流动相A 95%，流动B 5%;25min: 流动相A 95%，流动B 5%;流速:1.0mL/min;柱溫:30°C;进样量 巧光检测器条件:Ex = 280皿，血=348皿； 对照溶液的配制：分别精确称取2-甲基化嗦、2,5-二甲基化嗦、2,6-二甲基化嗦、2,3- 二甲基化嗦、2-乙基-6-甲基化嗦、2，3,5-Ξ甲基化嗦、2，3,5,6-四甲基化嗦、2,3-二甲基- 5-乙基化嗦对照品各100 ± lOmg，用乙醇溶解定容，得lOmg/mL标准储备液，储存于4°C冰箱 中； 供试品溶液的制备：取酒样1 OmL于具塞50mL离屯、管中，用12mo 1 /LNaOH调pH为12，再用 Imol/L化0H调抑为14,加化C1将其饱和，15mL乙酸振荡萃取15min，重复提取2次，收集乙酸 层，70°C水浴挥至约0.5ml，水定容ImL，过0.45皿滤膜一HPLC-FLD进样分析； 用外标法定量计算2-甲基化嗦、2,3-二甲基化嗦、2,5-二甲基化嗦、2,6-二甲基化嗦、 2，3,5-Ξ甲基化嗦、2-乙基-6-甲基化嗦、2，3,5,6-四甲基化嗦、2,3-二甲基-5-乙基化嗦8 种化嗦化合物的浓度。4. 根据权利要求1 -3中任一项所述的白酒中化嗦类化合物的高效液相色谱检测方法， 其特征在于:所述的流动相A的含憐酸水溶液的抑=2.1。5. 根据权利要求1 -3中任一项所述的白酒中化嗦类化合物的高效液相色谱检测方法， 其特征在于:所述对照溶液运样配制：分别精确称取2-甲基化嗦、2,5-二甲基化嗦、2,6-二 甲基化嗦、2,3-二甲基化嗦、2-乙基-6-甲基化嗦、2，3,5-Ξ甲基化嗦、2，3,5,6-四甲基化 嗦、2，3-二甲基-5-乙基化嗦对照品各lOOmg，用乙醇溶解定容，得lOmg/mL标准储备液，储存 于4°C冰箱中，用纯水稀释为质量浓度从低到高依次为0.化g/mL、0.化g/mL、0.化g/mL、1.化 g/血、2急旨/1111、5.〇4旨/1111的化嗦类混合对照品溶液，现憶峰面积，从质量浓度为横坐标、峰 面积为纵坐标，绘制标准溶液的工作曲线；6. 根据权利要求1 -3中任一项所述的白酒中化嗦类化合物的高效液相色谱检测方法， 其特征在于:所述检测方法按下式用外标法定量计算8种化嗦化合物的浓度。式中： X--试样中化嗦的含量，单位为mg/L C一一由标准曲线查得试样进样液中化嗦的浓度，单位为微克每毫升(yg/mL); CO一一由标准曲线查得空白试样进样液中化嗦的浓度，单位为微克每毫升(yg/mL); VI一一试样定容体积，单位为毫升(mL); V--取样量，单位为毫升(mL)7. 根据权利要求1 -3中任一项所述的白酒中化嗦类化合物的高效液相色谱检测方法， 其特征在于:所述的白酒的酒精浓度为38~53度。8. 根据权利要求1 -3中任一项所述的白酒中化嗦类化合物的高效液相色谱检测方法， 其特征在于，所述的白酒为：W曲类、酒母为糖化发酵剂，利用淀粉质原料，经蒸煮、糖化、发 酵、蒸馈、陈酿和勾兑而酿制而成的各类酒。9. 根据权利要求1 -3中任一项所述的白酒中化嗦类化合物的高效液相色谱检测方法， 其特征在于，所述的白酒中8种化嗦类化合物为:2-甲基化嗦、2,3-二甲基化嗦、2,5-二甲基 化嗦、2,6-二甲基化嗦、2,3,5-Ξ甲基化嗦、2-乙基-6-甲基化嗦、2,3,5,6-四甲基化嗦和2， 3-二甲基-5-乙基化嗦。
【文档编号】G01N30/02GK105842377SQ201610328926
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年5月18日
【发明人】龙四红, 孙棣, 廖妍俨, 冯永渝, 田志强, 寻思颖, 赵贵斌, 杨敏, 黄家岭, 杨波
【申请人】贵州省产品质量监督检验院