一种衍生化测定酚类雌激素的方法
【专利摘要】本发明公开一种衍生化测定酚类雌激素的方法。该方法包括同时衍生化6种酚类雌激素，并利用超高效液相色谱?质谱检测器快速测定。与现有技术相比，本发明提高6种雌激素的灵敏度，重现性好，回收率符合测定要求，变异系数小、检测成本低。
【专利说明】
一种衍生化测定酚类雌激素的方法
技术领域
[0001] 本发明属于兽药残留分析检测技术领域，通过柱前衍生化反应，超高效液相色谱-质谱检测器同时测定雌醇和雌酚。本发明可以同时对动物组织中雌醇和雌酚类雌激素的多 残留分析测定，也可对其他多酚类有机物进行分析测定。
【背景技术】
[0002] 雌激素是一类具有广泛生物活性的类固醇化合物，能够促进和维持女性相关的生 理作用，也会对内分泌系统、心血管系统、肌体新陈代谢、骨骼发育和皮肤等各方面发挥特 殊的作用。天然类固醇激素主要由动物的雌性或雄性性器官，肾上腺素等器官产生，是动物 生长发育的重要物质之一，如雌二醇、雌三醇、雌酮等。人工合成很多类似结构的类固醇激 素，如己烯雌酚、己烷雌酚和双烯雌酚等，这些激素在动物体内很难分解，通过食物链进入 人体后，可扰乱人体内分泌系统，导致男性女性化、男性生育能力下降、女性乳腺癌和卵巢 癌、女性性早熟等。欧盟已经禁止其在动物饲养中的使用，我国农业部235号公告中也规定， 己烯雌酚等雌激素在动物源性食品中不得检出。因此快速准确检测动物组织中这些雌激素 残留对于保障食品安全是很重要的。
[0003] 衍生化是为了弥补直接测定存在的目标化合物不稳定、离子化效率低等缺点，如 硅烷甲基化或者乙酰化反应把雌激素转化为挥发性成分才能进行GC-MS测定。LC-MS/MS是 雌激素药物残留检测的常用技术之一，其检测成本高，对部分难电离化合物如雌二醇、雌三 醇，需要衍生化反应提高离子化效率，国内外文献均有报道（I、M . Reza Anari，Ray Bakhtiar，Bing Zhu et al，Anal·Chem·2002，74，4136-4144，2、Hiroyuki Yamada， Yasuhiro Kuwahara,2 Yasuo Takamatsu et al?Biomed.Chromatogr.2000 ?14:333-337 ? 3、Robert E-NelsonjStefan K-GrebejDennis J.O'Kane et al.,Clinical Chemistry 2004,50(2)，373-384,4、赵怀鑫，孙学军，孙志伟等，分析化学，2009,37(2) ,187-193)。这些 方法均针对雌二醇、雌三醇目标化合物，未见关于雌酚类雌激素衍生化反应的报道，而且国 家没有同时测定雌醇和雌酚的标准。
[0004] 超高效液相色谱(UPLC)作为一种新的色谱仪，涵盖了小颗粒填料、低系统体积及 快速数据收集等全新技术，具有柱效高、分离时间短、溶剂消耗少等优点。目前UPLC系统带 有一款便携式质谱检测器(QDa)，灵敏度和准确度优于紫外检测器(PDA)，摆脱了常规质谱 仪的条件优化，操作简便，开机抽真空时间短（只要5min)，即开即用，适合日常大批量样品 的检测，但对于雌醇、雌酚类化合物也存在离子化效率低、灵敏度低等缺点，直接测定只能 达到mg/kg残留水平，不能满足痕量检测分析要求。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种通过柱前衍生化后用超高效液相色谱-质谱检测器，能 快速、低成本、灵敏度高地同时测定雌醇和雌酚类雌激素多残留的一种衍生化测定酚类雌 激素的方法。
[0006] 本发明的技术方案如下：
[0007] 1. 一种衍生化测定酚类雌激素的方法，其特征在于包括以下步骤：
[0008] (1)雌激素标准品的制备和测定
[0009] ①标准储备液的制备:将17β-雌二醇，雌三醇，雌酮，己烯雌酚，己烷雌酚，双烯雌 酚6种雌激素固体标准品分别用甲醇溶解后，分别用甲醇配成浓度为lmg/mL的6种标准储备 液，置于_20°C冰箱储存；
[0010] ②五个系列浓度混合标准液的制备:量取步骤（1)①制备的浓度为lmg/mL的17β-雌二醇标准储备液、浓度为lmg/mL的雌三醇标准储备液、浓度为lmg/mL的雌酮标准储备液、 浓度为lmg/mL的己烯雌酚标准储备液、浓度为lmg/mL的己烷雌酚标准储备液、浓度为Img/ mL的双烯雌酚标准储备液各取0.5mL混合到50mL容量瓶，用甲醇定容至50mL得混合工作液， 然后分取混合工作液用甲醇分别稀释为混合标准液A、混合标准液B、混合标准液C、混合标 准液D、混合标准液E五个系列浓度混合标准液，其中：
[0011] 混合标准液A中含有的17β-雌二醇、雌三醇、雌酮、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚6 个组分的浓度均为5ng/mL;
[0012] 混合标准液B中含有的17β-雌二醇、雌三醇、雌酮、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚6 个组分的浓度均为50ng/mL;
[0013] 混合标准液C中含有的17β_雌二醇、雌三醇、雌酮、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚6 个组分的浓度均为100ng/mL;
[0014] 混合标准液D中含有的17β-雌二醇、雌三醇、雌酮、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚6 个组分的浓度均为500ng/mL;
[0015] 混合标准液E中含有的17β-雌二醇、雌三醇、雌酮、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚6 个组分的浓度均为I 〇〇〇ng/mL;
[0016] ③内标的制备:将氘代17β-雌二醇(d3)用甲醇溶解后，用甲醇配成浓度为lmg/mL 的内标标准储备液，量取内标标准储备液，加入甲醇配制成浓度为500ng/mL的内标；
[0017] ④丹磺酰氯衍生试剂的制备:将固体丹磺酰氯溶解于有机溶剂，用该有机溶剂配 制成浓度为lmg/mL丹磺酰氯衍生试剂，装入棕色瓶，置于-20°C冰箱储存；
[0018] ⑤分别取ImL步骤(1)②配制的五个系列浓度的混合标准液，在每一个混合标准液 中加入步骤（1)③所制备的浓度为500ng/mL的内标I OOyL，每一个混合标准液加入内标混合 均匀后用氮气吹干，分别得到对应的五个混合标样;混合标准液A对应的混合标样记为混合 标样A S混合标准液B对应的混合标样记为混合标样B \混合标准液C对应的混合标样记为 混合标样C \混合标准液D对应的混合标样记为混合标样D \混合标准液E对应的混合标样 记为混合标样E ' ；
[0019] ⑥衍生化反应和超高效液相色谱-质谱检测器测定
[0020] 步骤（1)⑤所述的五个混合标样均按如下方法进行衍生化反应:每个混合标样中 加入步骤（1)④制备的lmg/mL丹磺酰氯衍生试剂10~1000 yU用碳酸氢钠或氢氧化钠调pH 为8.0~11.0，旋涡混合30s，在温度45°C~70°C，衍生化反应10~30min;
[0021 ] 每个衍生化反应后的溶液自然冷至室温后，氮气吹干，再加入混合液溶解，所述混 合液由0.65mL甲醇溶液和lmmol/L乙酸铵溶液0.35mL混合而成；溶解后的溶液中有机相用 滤膜过滤得滤液，所得滤液进超高效液相色谱-质谱检测器测定，超高效液相色谱-质谱检 测器测定条件如下：
[0022] 色谱柱:waters BEH C18 2.1\50臟。色谱柱温度：35°(：。进样体积：1(^^
[0023]流动相为甲醇：lmmol/L乙酸铵，设置梯度洗脱，梯度洗脱条件按表1:
[0024] 表1梯度洗脱备件
[0026] 设置质谱检测器扫描方式:选择离子模式，按表2所示质谱检测器测定衍生产物的 条件，正负离子同时扫描，扫描质量数范围为m/z = 40~600,锥孔电压15V，采样速率8点/ 秒，毛细管电压〇. 8kv;
[0027] 表2质谱检测器测定衍生产物的条件
[0029]⑦经超高效液相色谱-质谱检测器测定得到17β_雌二醇，雌三醇，雌酮，己烯雌酚， 己烷雌酚，双烯雌酚6种雌激素的峰面积和内标的峰面积，分别以6种雌激素的峰面积与内 标峰面积之比值为纵坐标，步骤(1)②中的五个混合标准液的浓度值为横坐标，绘制对应的 六个标准工作曲线；
[0030] (2)待检样品检测
[0031] ①准确称取5g动物组织待检样品，加入IOOyL步骤（1)③所制备的浓度为500ng/mL 的内标，用25mL乙腈提取，5000rpm，离心5min，收集上清液，氮气吹干；
[0032]②加入步骤（1)④所述的lmg/mL丹磺酰氯衍生试剂IO-1000 yL后，用碳酸氢钠或氢 氧化钠调pH为8.0~11.0，旋涡混合30s，在温度45°C~70°C，衍生化反应10~30min;
[0033] ③衍生化反应后的溶液自然冷至室温后，氮气吹干，再加入混合液溶解，所述混合 液由0.65mL甲醇溶液和lmmol/L乙酸铵溶液0.35mL混合而成；溶解后的溶液中有机相用滤 膜过滤得滤液，所得滤液进超高效液相色谱-质谱检测器测定，按步骤（1)⑥所述的超高效 液相色谱-质谱检测器测定条件测定；
[0034] ④经超高效液相色谱-质谱检测器测定，得到待检样品峰的保留时间和峰面积，与 步骤（1)⑥所得的6种雌激素标样的保留时间进行比较，确定待检样品中所含雌激素的种 类，与步骤(1)⑦中所对应的雌激素的标准工作曲线比较，得到所含雌激素的含量。
[0035] 2.根据技术方案1所述的衍生化测定酚类雌激素的方法，其特征在于:步骤（1)④ 中所述的有机溶剂为丙酮或者苯。
[0036] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0037] 1、通过本发明的柱前衍生化反应方法，提高了 17β_雌二醇、雌三醇、雌酮、己烯雌 酚、己烷雌酚、双烯雌酚以及内标氘代17β-雌二醇(d3)的离子化效率，灵敏度得到了提高。 [0038] 2、目前还没有采用超高效液相色谱-质谱检测器同时对17β_雌二醇、雌三醇、雌 酮、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚6种雌激素多残留的检测，本发明采用超高效液相色谱-质谱检测器及其参数设定进行定性和定量分析，定量限可达到1~2yg/kg，结果重现性良 好，3个添加浓度回收率为65%~121%，6次重复实验的变异系数小于13%。
[0039] 3、本发明方法检测成本低。现有串联质谱仪器价格高达250万元，而超高效液相色 谱-质谱检测器的价格70万元，相比串联质谱仪器，本发明方法检测成本低。
【附图说明】
[0040]图1是17β-雌二醇标样衍生物的色谱图，图中纵坐标是强度，横坐标是时间。
[0041 ]图2是雌三醇标样衍生物的色谱图，图中纵坐标是强度，横坐标是时间。
[0042]图3是雌酮标样衍生物和己烯雌酚标样衍生物的色谱图，图中纵坐标是强度，横坐 标是时间。
[0043] 图4是己烷雌酚标样衍生物的色谱图，图中纵坐标是强度，横坐标是时间。
[0044] 图5是双烯雌酚标样衍生物的色谱图，图中纵坐标是强度，横坐标是时间。
[0045] 图6是内标标样衍生物的色谱图，图中纵坐标是强度，横坐标是时间。
[0046] 图7是牛奶加标样本的17β_雌二醇衍生物的色谱图，图中纵坐标是强度，横坐标是 时间。
[0047] 图8是牛奶加标样本的雌三醇衍生物的色谱图，图中纵坐标是强度，横坐标是时 间。
[0048]图9是牛奶加标样本的雌酮衍生物和己烯雌酚衍生物的色谱图，图中纵坐标是强 度，横坐标是时间。
[0049] 图10是牛奶加标样本的己烷雌酚衍生物的色谱图，图中纵坐标是强度，横坐标是 时间。
[0050] 图11是牛奶加标样本的双烯雌酚衍生物的色谱图，图中纵坐标是强度，横坐标是 时间。
[0051] 图12是牛奶加标样本的内标衍生物的色谱图，图中纵坐标是强度，横坐标是时间。
【具体实施方式】
[0052]以下实施例所用的所有原料、试剂等均为市售。各实施例中无特殊说明的为常规 方法。
[0053]实施例1衍生化反应条件
[0054]①丹磺酰氯衍生试剂的制备:将固体丹磺酰氯溶解于丙酮溶剂，配制浓度lmg/mL 丹磺酰氯衍生试剂，装入棕色瓶，置于-20°C冰箱储存。
[0055] ②衍生化反应条件1:加入步骤（1)①制备的lmg/mL丹磺酰氯衍生试剂10yL，用碳 酸氢钠调节混合混合的pH为8.0，旋涡混合30s，在温度45°C，衍生化反应lOmin。
[0056] ③衍生化反应条件2:加入步骤（1)①制备的lmg/mL丹磺酰氯衍生试剂IOOyU用碳 酸氢钠调节混合混合的pH为9.0，旋涡混合30s，在温度55°C，衍生化反应lOmin。
[0057] ④衍生化反应条件3:加入步骤（1)①制备的lmg/mL丹磺酰氯衍生试剂200yL，用碳 酸氢钠调节混合溶液的pH为10.0，旋涡混合30s，在温度55°C，衍生化反应30min。
[0058] ⑤衍生化反应条件4:加入步骤（1)①制备的lmg/mL丹磺酰氯衍生试剂500yL，用碳 酸氢钠调节混合溶液的pH为11.0,旋涡混合30s，在温度65°C，衍生化反应20min。
[0059] ⑥衍生化反应条件5:加入步骤（1)①制备的lmg/mL丹磺酰氯衍生试剂lOOOyL，用 碳酸氢钠调节混合溶液的pH为10.0，旋涡混合30s，在温度70°C，衍生化反应10min。
[0060] 实施例2雌激素标准样品的制备和雌激素标准曲线绘制 [00611 (1)雌激素标准样品的制备
[0062]①标准储备液的制备:将如下6种雌激素固体标准品：17β_雌二醇，雌三醇，雌酮， 己烯雌酚，己烷雌酚，双烯雌酚，分别用甲醇溶解，分别配成浓度为lmg/mL的如下6种标准储 备液：
[0063] lmg/mL的17β-雌二醇标准储备液；
[0064] lmg/mL的雌三醇标准储备液；
[0065] lmg/mL的雌酮标准储备液；
[0066] lmg/mL的己烯雌酚标准储备液；
[0067] lmg/mL的己烷雌酚标准储备液；
[0068] lmg/mL的双烯雌酚标准储备液；
[0069] 以上6种标准储备液均置于_20°C冰箱储存。
[0070] ②五个系列浓度混合标准液的制备:量取步骤⑴①制备的浓度为lmg/mL的17β-雌二醇标准储备液、浓度为lmg/mL的雌三醇标准储备液、浓度为lmg/mL的雌酮标准储备液、 浓度为lmg/mL的己烯雌酚标准储备液、浓度为lmg/mL的己烷雌酚标准储备液、浓度为Img/ mL的双烯雌酚标准储备液各取0.5mL混合到50mL容量瓶，用甲醇定容至50mL得混合工作液， 然后分取混合工作液用甲醇分别稀释为混合标准液A、混合标准液B、混合标准液C、混合标 准液D、混合标准液E 5个不同浓度的混合标准液，其中：
[0071] 混合标准液A中含有的17β-雌二醇、雌三醇、雌酮、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚6 个组分的浓度均为5ng/mL;
[0072] 混合标准液B中含有的17β_雌二醇、雌三醇、雌酮、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚6 个组分的浓度均为50ng/mL;
[0073] 混合标准液C中含有的17β_雌二醇、雌三醇、雌酮、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚6 个组分的浓度均为100ng/mL;
[0074] 混合标准液D中含有的17β_雌二醇、雌三醇、雌酮、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚6 个组分的浓度均为500ng/mL;
[0075] 混合标准液E中含有的17β_雌二醇、雌三醇、雌酮、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚6 个组分的浓度均为I 〇〇〇ng/mL。
[0076] ③内标的制备:将氘代17β_雌二醇(d3)用甲醇溶解后，用甲醇配成浓度为lmg/mL 的内标标准储备液，量取内标标准储备液，加入甲醇配制成浓度为500ng/mL的内标。
[0077] ④丹磺酰氯衍生试剂的制备:将固体丹磺酰氯溶解于丙酮中，用丙酮配制成浓度 为lmg/mL丹磺酰氯衍生试剂，装入棕色瓶，置于-20°C冰箱储存。
[0078] ⑤分别取ImL步骤(1)②配制的五个系列浓度的混合标准液，在每一个混合标准液 中加入步骤（1)③所制备的浓度为500ng/mL的内标I OOyL，每一个混合标准液加入内标混合 均匀后用氮气吹干，分别得到对应的五个混合标样;混合标准液A对应的混合标样记为混合 标样A S混合标准液B对应的混合标样记为混合标样B \混合标准液C对应的混合标样记为 混合标样C \混合标准液D对应的混合标样记为混合标样D \混合标准液E对应的混合标样 记为混合标样E'。
[0079] (2)衍生化反应和超高效液相色谱-质谱检测器测定
[0080] ①步骤（1)⑤所述的五个混合标样均按如下方法进行衍生化反应:每个混合标样 中加入步骤（1)④制备的lmg/mL丹磺酰氯衍生试剂200yL，用碳酸氢钠调pH为10.0，旋涡混 合30s，在温度60°C，衍生化反应10min;
[0081 ] 每个衍生化反应后的溶液自然冷至室温后，氮气吹干，再加入混合液溶解，所述混 合液由0.65mL甲醇溶液和lmmol/L乙酸铵溶液0.35mL混合而成；溶解后的溶液中有机相用 滤膜过滤得滤液，所得滤液进超高效液相色谱-质谱检测器测定，超高效液相色谱-质谱检 测器测定条件如下：
[0082] 色谱柱:waters BEH C18 2.1\50臟。色谱柱温度：35°(：。进样体积：1(^^
[0083]流动相为甲醇：lmmol/L乙酸铵，设置梯度洗脱，梯度洗脱条件按表1:
[0084] 弄1梯庶洗脱备件
[0086] 设置质谱检测器扫描方式:选择离子模式，按表2所示质谱检测器测定衍生产物的 条件，正负离子同时扫描，扫描质量数范围为m/z = 40~600,锥孔电压15V，采样速率8点/ 秒;毛细管电压〇. 8kv;
[0087] 表2质谱检测器测定衍生产物的条件
[0089] ②经超高效液相色谱-质谱检测器测定得到17β_雌二醇，雌三醇，雌酮，己烯雌酚， 己烷雌酚，双烯雌酚6种雌激素的峰面积和内标的峰面积，每个标准工作曲线按如下方法绘 制：
[0090] 以混合标样A'至混合标样E'中的每种雌激素的5个浓度对应的峰面积分别与内标 峰面积之比所得到的5个比值为纵坐标，以步骤（1)②中的五个混合标准液的浓度值5ng/ mL、50ng/mL、100ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL为横坐标，绘制对应的标准工作曲线；详见表 3〇
[0091] 6个标准曲线的线性范围为5~1000ng/mL，相关系数R2M). 995，6种雌激素衍生产 物有很好的线性关系，表明本发明方法和仪器条件合理可行。
[0092] 17β_雌二醇、雌三醇、雌酮、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚衍生物和内标衍生物的 色谱图见图1-图6。
[0093]表3 6种雌激素回归方程，相关系数及浓度范围 L 〇〇95 J 买施例3午奶样本检测
[0096] (1)牛奶样本的提取
[0097]市场随机选择牛奶为实验样本，并对上述6种雌激素残留同时进行检测。共设3个 添加浓度，分别为2，10，50yg/kg。分别设一个空白样本，每个浓度重复6次，进行重复性实 验，分别计算回收率和变异系数。
[0098] (2)衍生化反应
[0099] 准确称取5g样本，加入实施例2步骤（1)③所制备的浓度为500ng/mL的内标100yL， 经提取净化之后收集洗脱液，氮气吹干，加入体积200yL实施例2步骤（1)④制备的lmg/mL丹 磺酰氯衍生试剂，用碳酸氢钠调节pH为10，旋涡混合30s，在温度60 °C下反应时间为30min， 得衍生化产物。取出自然冷至室温后，氮气吹干，再加入混合液溶解，所述混合液由0.65mL 甲醇溶液和lmmol/L乙酸铵溶液0.35mL混合而成，溶解后的溶液中有机相用滤膜过滤得滤 液，所得滤液进超高效液相色谱-质谱检测器测定，测定条件按照实施例2中步骤(2)①所述 的超高效液相色谱-质谱检测器测定条件。
[0100] (3)检测结果
[0101] 检测结果见表4。六种雌激素在2-50yg/kg的添加浓度范围内的定量限为l-2yg/ kg，回收率范围为68%-121%，RSD范围为4.3%-13.8%，表明本发明方法对于6种雌激素的 检测灵敏度低，稳定性较好。
[0102] 表4 6种雌激素的回收率，RSD，定量限n = 6
【主权项】
1. 一种衍生化测定酪类雌激素的方法，其特征在于包括W下步骤： (1)雌激素标准品的制备和测定 ① 标准储备液的制备:将17β-雌二醇，雌Ξ醇，雌酬，己締雌酪，己烧雌酪，双締雌酪6种 雌激素固体标准品分别用甲醇溶解后，分别用甲醇配成浓度为Img/mL的6种标准储备液，置 于-20°C冰箱储存； ② 五个系列浓度混合标准液的制备:量取步骤（1)①制备的浓度为Img/mL的17β-雌二 醇标准储备液、浓度为Img/mL的雌Ξ醇标准储备液、浓度为Img/mL的雌酬标准储备液、浓度 为Img/mL的己締雌酪标准储备液、浓度为Img/mL的己烧雌酪标准储备液、浓度为Img/mL的 双締雌酪标准储备液各取0.5mL混合到50mL容量瓶，用甲醇定容至50血得混合工作液，然后 分取混合工作液用甲醇分别稀释为混合标准液A、混合标准液B、混合标准液C、混合标准液 D、混合标准液E五个系列浓度混合标准液，其中： 混合标准液A中含有的17β-雌二醇、雌Ξ醇、雌酬、己締雌酪、己烧雌酪、双締雌酪6个组 分的浓度均为5ng/ni; 混合标准液B中含有的17β-雌二醇、雌Ξ醇、雌酬、己締雌酪、己烧雌酪、双締雌酪6个组 分的浓度均为50ng/ni; 混合标准液C中含有的17β-雌二醇、雌Ξ醇、雌酬、己締雌酪、己烧雌酪、双締雌酪6个组 分的浓度均为10化g/ni; 混合标准液D中含有的17β-雌二醇、雌Ξ醇、雌酬、己締雌酪、己烧雌酪、双締雌酪6个组 分的浓度均为50化g/ni; 混合标准液E中含有的17β-雌二醇、雌Ξ醇、雌酬、己締雌酪、己烧雌酪、双締雌酪6个组 分的浓度均为1 OOOng/ni; ③ 内标的制备：将気代17β-雌二醇（d3)用甲醇溶解后，用甲醇配成浓度为Img/mL的内 标标准储备液，量取内标标准储备液，加入甲醇配制成浓度为50化g/mL的内标； ④ 丹横酷氯衍生试剂的制备:将固体丹横酷氯溶解于有机溶剂，用该有机溶剂配制成 浓度为Img/mL丹横酷氯衍生试剂，装入栋色瓶，置于-20°C冰箱储存； ⑤ 分别取ImL步骤（1)②配制的五个系列浓度的混合标准液，在每一个混合标准液中加 入步骤(1)③所制备的浓度为50化g/mL的内标10化L，每一个混合标准液加入内标混合均匀 后用氮气吹干，分别得到对应的五个混合标样;混合标准液A对应的混合标样记为混合标样 ，混合标准液B对应的混合标样记为混合标样8\混合标准液C对应的混合标样记为混合 标样C\混合标准液D对应的混合标样记为混合标样D\混合标准液Ε对应的混合标样记为 混合标样E' ； ⑥ 衍生化反应和超高效液相色谱-质谱检测器测定 步骤（1)⑤所述的五个混合标样均按如下方法进行衍生化反应:每个混合标样中加入 步骤（1)④制备的Img/mL丹横酷氯衍生试剂10~1000化，用碳酸氨钢或氨氧化钢调抑为8.0 ~11.0，旋满混合30s，在溫度45°C~70°C，衍生化反应10~30min; 每个衍生化反应后的溶液自然冷至室溫后，氮气吹干，再加入混合液溶解，所述混合液 由0.65mL甲醇溶液和Immol/L乙酸锭溶液0.35mL混合而成;溶解后的溶液中有机相用滤膜 过滤得滤液，所得滤液进超高效液相色谱-质谱检测器测定，超高效液相色谱-质谱检测器 测定条件如下： 色谱柱:waters肥Η C18 2.1X50mm。色谱柱溫度:35°C。进样体积 流动相为甲醇：Immol/L乙酸锭，设置梯度洗脱，梯度洗脱条件按表1: 表1梯度洗脱条件设置质谱检测器扫描方式：选择离子模式，按表2所示质谱检测器测定衍生产物的条 件，正负离子同时扫描，扫描质量数范围为m/z = 40~600,锥孔电压15V，采样速率8点/秒， 毛细管电压〇.8kv; 表2质谱检测器测定衍生产物的条件⑦经超高效液相色谱-质谱检测器测定得到17β-雌二醇，雌Ξ醇，雌酬，己締雌酪，己烧 雌酪，双締雌酪6种雌激素的峰面积和内标的峰面积，分别W6种雌激素的峰面积与内标峰 面积之比值为纵坐标，步骤(1)②中的五个混合标准液的浓度值为横坐标，绘制对应的六个 标准工作曲线； (2)待检样品检测 ① 准确称取5g动物组织待检样品，加入1(Κ)化步骤（1)③所制备的浓度为50化g/mL的内 标，用25mL乙腊提取，500化pm，离屯、5min，收集上清液，氮气吹干； ② 加入步骤（1)④所述的Img/mL丹横酷氯衍生试剂10-100化L后，用碳酸氨钢或氨氧化 钢调抑为8.0~11.0，旋满混合30s，在溫度45°C~70°C，衍生化反应10~30min; ③ 衍生化反应后的溶液自然冷至室溫后，氮气吹干，再加入混合液溶解，所述混合液由 0.65mL甲醇溶液和Immol/L乙酸锭溶液0.35mL混合而成;溶解后的溶液中有机相用滤膜过 滤得滤液，所得滤液进超高效液相色谱-质谱检测器测定，按步骤（1)⑥所述的超高效液相 色谱-质谱检测器测定条件测定； ④ 经超高效液相色谱-质谱检测器测定，得到待检样品峰的保留时间和峰面积，与步骤 (1)⑥所得的6种雌激素标样的保留时间进行比较，确定待检样品中所含雌激素的种类，与 步骤(1)⑦中所对应的雌激素的标准工作曲线比较，得到所含雌激素的含量。2.根据技术方案1所述的衍生化测定酪类雌激素的方法，其特征在于:步骤（1)④中所 述的有机溶剂为丙酬或者苯。
【文档编号】G01N30/88GK105842379SQ201610387235
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年6月2日
【发明人】刘宏程, 黎其万, 林涛, 李宁, 邵金良, 汪禄祥
【申请人】云南省农业科学院质量标准与检测技术研究所