芪骨胶囊的检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种芪骨胶囊的检测方法，包括成分鉴别和含量测定方法，采用薄层色谱法试验鉴别其成分，要求供试品色谱中在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；采用高效液相色谱法测定淫羊藿的含量，要求每粒芪骨胶囊含淫羊藿以淫羊藿苷计，不得少于1.0mg。该方法可使芪骨胶囊产品更具整体性、特征性和稳定性，利于批量控制产品的质量。
【专利说明】
芪骨胶囊的检测方法
技术领域
[0001] 本发明涉及药物的检测方法，具体为芪骨胶囊的检测方法。
【背景技术】
[0002] 芪骨胶囊主治原发性骨质疏松症属肝肾不足证者，表现为骨密度降低、腰膝酸软 无力、腰背疼痛、头目眩晕、步履艰难、不能持重、耳鸣等，起滋养肝肾、强筋健骨的作用。芪 骨胶囊为硬胶囊，内容物为棕黄色或棕褐色的粉末，其成分为淫羊藿、制何首乌、黄芪、石 斛、肉苁蓉、骨碎补、菊花，由于其成分众多，需要具备有效的方法来检测，以稳定其疗效，保 证用药质量。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于提供芪骨胶囊的检测方法，使产品质量得到更好的控制。为实 现上述目的，本发明采用以下技术方案： 芪骨胶囊的检测方法，包括成分鉴别及含量检测，其成分鉴别过程如下。
[0004] (1)取芪骨胶囊内容物I. 5g，加甲醇20ml，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣 加水20ml使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次20ml，合并正丁醇液，先用氨试液 50ml洗涤，再用正丁醇饱和的水洗涤2次，每次50ml，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇Iml使溶 解，作为供试品溶液；另取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml含〇. Img的溶液，作为对照品 溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体 积比13 :7 :2的三氯甲烷-甲醇-水在KTC以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾 干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105°C加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照品色谱相 应的位置上，显相同颜色的斑点。
[0005] (2)取芪骨胶囊内容物I. 5g，加正丁醇20ml，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，残 渣加甲醇Iml使溶解，作为供试品溶液；另取柚皮苷对照品，加甲醇制成每1ml含Img的溶 液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各2 μ 1，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以体积比10 :2 :3的乙酸乙酯-甲酸-水的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干， 喷以1%三氯化铝乙醇溶液，105°C加热至斑点清晰，置365nm紫外光灯下检视，供试品色谱 中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
[0006] (3)取芪骨胶囊内容物2. 0g，加甲醇25ml，超声处理15分钟，滤过，滤液浓缩至近 干，残渣加甲醇3ml溶解，作为供试品溶液；另取松果菊苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含 Img的对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各2μ1，分别点于同一聚酰胺薄 膜上，以体积比2 :1 :7甲醇-醋酸-水为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外灯下检视， 供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
[0007] 以上的薄层色谱法依据中国药典2005年版一部附录VI B测定，芪骨胶囊内容物 经上述三项检测，均在与对照品色谱相对应的位置上显示相同颜色的荧光斑点，则其成分 鉴别合格，否则，不合格。
[0008] 含量检测采用高效液相色谱法（中国药典2005年版一部附录VI D)测定。
[0009] (1)色谱条件与系统适用性试验，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以体积比为 45 :50 :5的甲醇-水-冰醋酸为流动相，检测波长270nm，理论板数按淫羊藿苷峰计算应不 低于1500。
[0010] (2)对照品溶液的制备，精密称取淫羊藿苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含 20 μ g的溶液，即得。
[0011] (3)供试品溶液的制备，取芪骨胶囊内容物约0. 15g，精密称定，置具塞锥形瓶中， 精密加入甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失 的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
[0012] (4)分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μ 1，注入液相色谱仪，计算，即 得。每粒芪骨胶囊含淫羊藿以淫羊藿苷计，不得少于l.Omg。
[0013] 通过以上的成分鉴别和含量检测，结果均合格的产品其整体性较好，质量较高。通 过该方法对芪骨胶囊进行检测，可使芪骨胶囊产品更具整体性、特征性和稳定性，利于批量 控制产品的质量。
【附图说明】
[0014] 图1为芪骨胶囊中黄芪薄层的色谱图； 图2为芪骨胶囊中骨碎补薄层的色谱图； 图3为不同样品中骨碎补特征斑点的Rf值比较； 图4为芪骨胶囊中肉苁蓉薄层色谱图。
【具体实施方式】
[0015] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对 本发明进行进一步详细说明。
[0016] 本发明的芪骨胶囊成分为淫羊藿、制何首乌、黄芪、石斛、肉苁蓉、骨碎补、菊花，国 药准字Z20090656,厦门中药厂有限公司生产。本发明公开了芪骨胶囊的检测方法，从成分 鉴别和含量测定两个方面来检测产品。
[0017] 实施例一.芪骨胶囊黄芪的薄层鉴别 取芪骨胶囊内容物I. 5g，加甲醇20ml，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水20ml 使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次20ml，合并正丁醇液，先用氨试液50ml洗涤， 再用正丁醇饱和的水洗涤2次，每次50ml，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇Iml使溶解，作为供试 品溶液。
[0018] 另取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.1 mg的溶液，作为对照品溶液。
[0019] 照薄层色谱法试验（中国药典2005年版一部附录VI B)，吸取上述两种溶液各 5 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比13 :7 :2的三氯甲烷-甲醇-水在KTC以下 放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，l〇5°C加热至斑点显 色清晰，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
[0020] 如图1色谱图中，各数字代表的含义如下：1.黄芪甲苷对照品，2.供试品，3.空白 对照，供试品色谱在与对照品色谱相应的位置上，日光下显相同的棕褐色斑点，365nm的紫 外光灯下显相同的橙黄色突光斑点。
[0021] 实施例二.芪骨胶囊骨碎补的薄层鉴别 取芪骨胶囊内容物I. 5g，加正丁醇20ml，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇 Iml使溶解，作为供试品溶液。
[0022] 另取柚皮苷对照品，加甲醇制成每1ml含Img的溶液，作为对照品溶液。
[0023] 照薄层色谱法试验（中国药典2005年版一部附录VI B)，吸取上述两种溶液各 2 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比10 :2 :3的乙酸乙酯-甲酸-水的上层溶液 为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%三氯化铝乙醇溶液，105°C加热至斑点清晰，置365nm紫 外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
[0024] 如图2所示为通过本鉴别方法得到的色谱图，其中，各数字代表的含义如下：1、2、 3、4为供试品，5为柚皮苷对照品，6为阴性对照样品，供试品色谱中，在与对照品色谱相应 的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
[0025] 在该实验中，偶尔会发现Rf值不一致的问题，因此进行了进一步的实验论证。设 置5个样品的薄层Rf比较，结果见附图3,附图3中各数字代表的含义如下： 1.空白对照组(骨碎补缺味）6ul，2.骨碎补对照药材8ul，3.柚皮苷对照品2ul，4.密 骨全方6ul+柚皮苷对照品2ul，5.密骨全方6ul，由此可以看出空白对照品中无干扰。柚 皮苷对照品的薄层斑点比密骨全方和骨碎补对照药材样品中柚皮苷斑点位置略高(约半个 斑点），密骨全方+柚皮苷样品中只出现一个斑点，且其位置与骨碎补对照药材和密骨全方 样品中柚皮苷斑点位置一致，都比柚皮苷对照品样品中柚皮苷斑点略低。由此判断，密骨 全方中的特征斑点虽然比柚皮苷对照品中的柚皮苷斑点略低，但该斑点确为柚皮苷特征斑 点。推测他们Rf值不完全一致可能与复方中其他成分影响了柚皮苷成分的迁移速度有关。 柚皮苷对照品和全方中的柚皮苷特征斑点仅相差半个斑点位置，且在相关的位置上无其他 成分干扰，因此，可采用本色谱条件，进行芪骨胶囊中骨碎补药材的薄层鉴别。
[0026] 实施例三.芪骨胶囊肉苁蓉的薄层鉴别 1.对照品的选择 前期试验中，曾选择肉苁蓉生药为对照品，并按以下方式进行：取全方及肉苁蓉缺味， 按照制备工艺方法制成干浸膏，取1/6贴(约2. 5克)，加0. 5克(约20%)糊精充分研磨后， 加入甲醇IOml，超声处理30分钟，滤过，供点样用。另取苁蓉生药lg，同法制成药材对照 液。展开条件：乙酸乙酯-甲醇-9%醋酸（20 :3 :2)上行展开后喷以5%三氯化铁乙醇液显 色。该法经显色后，药材对照的斑点很淡，且背景模糊。
[0027] 通过多次实验，增加毛蕊花糖苷及松果菊甘为对照品，实验过程如下： 取芪骨胶囊内容物2. 0g，加甲醇25ml，超声处理15分钟，滤过，滤液浓缩至近干，残渣 加甲醇3ml溶解，作为供试品溶液。
[0028] 另取毛蕊花糖苷、松果菊苷对照品适量，分别加甲醇制成每1ml含Img的对照品溶 液，取缺肉苁蓉的阴性对照药2g，同供试液制备方法制成阴性对照液。
[0029] 照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各2μ1，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以体 积比2 :1 :7甲醇-醋酸-水为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外灯下检视，供试品色 谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
[0030] 如图4所示，各数字代表的含义如下：1.毛蕊花糖苷对照品，2.松果菊苷对照 品，3-5.供试样品，6.肉灰蓉缺味。
[0031] 从以上实验发现：采用松果菊苷作对照品，阴性对照液无干扰；而在与毛蕊花糖 苷对照品色谱相应的位置上，供试品色谱中虽然有相同颜色的荧光斑点，但是阴性对照液 有干扰。采用松果菊苷为对照品，并按该方法检测的测定效果好，因此最终选择松果菊苷作 为对照品进行肉苁蓉的薄层鉴别。
[0032] 2.点样量的选择 对点样量进行实验比较，得出2μ1较合适，?μL斑点不够清晰，5μ1背景色较重，影响检 视。因此，确定点样量定为2μ1，检测效果最好。
[0033] 通过反复实验，得出最终实验过程方法如下：取芪骨胶囊内容物2. 0g，加甲醇 25ml，超声处理15分钟，滤过，滤液浓缩至近干，残渣加甲醇3ml溶解，作为供试品溶液。另 取松果菊苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含Img的对照品溶液。
[0034] 照薄层色谱法试验（中国药典2005年版一部附录VI B)，吸取上述两种溶液各 2μ1，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以体积比2:1 :7甲醇-醋酸-水为展开剂，展开，取出，晾 干，置365nm紫外灯下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的 荧光斑点。
[0035] 实施例四.芪骨胶囊淫羊藿含量测定 芪骨胶囊的包装采用药用塑料瓶，每瓶装54粒或每瓶装90粒；或采用药用铝塑泡罩， 每盒三板，每板12粒。每粒芪骨胶囊内容物约0.55克，其用法用量为：口服，一次3粒，一 日3次。每粒芪骨胶囊的淫羊藿含量依据淫羊藿苷(：3迟4。015计，不得少于1.0 mg。
[0036] 1.材料与仪器 淫羊藿苷对照品（0737-9508)由中国药品生物制品检定所提供。
[0037] 甲醇为色谱纯，水为双蒸水，冰醋酸为分析纯。
[0038] 2.仪器 Waters高效液相色谱仪(包括510泵，7725i进样阀，Waters484紫外检测器，CDMC-2A 数据处理机）；SB2200超声波发生器（中美合资上海必能信超声有限公司，80W)。
[0039] 3.色谱分析条件 色谱柱：Nova_pak，C1S(3. 9_X 150mm，4u)，Nova_pak (318预柱；流动相为甲醇-水-冰 醋酸（45:50:5)，使用前经减压抽滤脱气；流速0. 7ml/min ;检测波长270nm;纸速为2mm/ min ;保留时间约15min ;理论塔板数按淫羊藿苷计不低于1500 ;数据处理定量方法为外标 峰面积测定法。
[0040] 4.标准曲线测定 精密称取淫羊藿苷标准品I. 13mg，置25ml容量瓶中，加甲醇溶解至刻度，摇匀（每1ml 含淫羊藿苷〇. 〇452mg)。精密吸取lml，置5ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀（每1ml 含淫羊藿苷〇. 00904mg)。分别精密吸取0. 0452mg/ml的对照溶液3. 0、5. 0、10、12. 5ul和 0. 00904mg/ml对照溶液2. 0、5. Oul，注入高效液相色谱仪中，以淫羊藿苷的量为横坐标，峰 面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线。其回归方程为：Y=3431. 57574X-4. 34565, r=0. 9999， 线性范围为0.01808yg~0.565yg。见表1。 愈::! _'議__*_|
[0041] 5.样品液制备 取芪骨胶囊药粉0. 15g，精密称定，置50ml锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称定重量，超 声处理30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供 试品溶液。
[0042] 6.精密度试验 精密吸取对照品溶液，先后进样5次，淫羊藿苷峰面积的RSD=L 79% (n=5)，见表2。
[0043] 7.重复性试验 同一批号样品5份，按样品测试条件测定，淫羊藿苷的含量的RSD为2. 01%，见表3。
[0044] 8.稳定性试验 将同一样品液于〇, 1，2天测定，结果表明淫羊藿苷峰积分面积的RSD=3. 86% (n=3)，见 表4。
[0045] 9.空白对照液制备与测定 按处方比例和工艺，制成不含淫羊藿的空白样品，按样品液的制备方法制备、测定。结 果表明，处方中其他药材和辅料不干扰淫羊藿苷的测定。
[0046] 10.加样回收率测定 在已知含量的样品分别加入不同量的淫羊藿苷对照品，配制成加样样品液。将加样样 品液分别按上述色谱条件测定其含量，并计算加样回收率。结果见表5。
[0047] 11.不同提取方法和提取时间选择 将同一样品称取5份，1份加入稀乙醇25ml，回流提取30min，其余4份加入甲醇25ml， 分别回流提取30min、超声提取20、30、45min制备供试品液，按照上述色谱条件测定其含 量，结果见表6。
[0048] 由表可知，甲醇25ml超声提取30min基本使样品中的淫羊藿苷提取完全。故选用 甲醇25ml超声提取30min。
[0049] 12.成品含量测定 测定了临床前研究的4批中试样品和临床研究期间的1批临床试验样品、9批中试样品 中淫羊藿苷的含量，结果见表7、8。
[0050] 上述研究可以看出，淫羊藿苷含量测定的线性范围为0. 01808 μ g~0. 565 μ g，线 性回归方程为 Y=3431. 57574X-4. 34565, r=0. 9999。平均回收率为 98. 95%，RSD 为 2. 44%。
[0051] 目前中国药典2005年版一部中对淫羊藿中淫羊藿苷的含量规定应不低于0. 50%， 以50%的转移率计算，则每粒胶囊中淫羊藿苷的理论含量应为I. 035mg/粒，因此将芪骨胶 囊中淫羊藿苷含量限度定为每粒胶囊中含淫羊藿苷的含量不低于1.0 mg/粒，与临床研究 质量标准一致，采用该法检测芪骨胶囊中含淫羊藿苷的含量简便、准确，重现性好，可作为 芪骨胶囊质量控制的方法。
【主权项】
1.芪骨胶囊的检测方法，其包括成分鉴别及含量检测，其特征在于： 成分鉴别采用薄层色谱法测定，其过程如下， (1) 黄芪的薄层鉴别：取芪骨胶囊内容物1. 5g，加甲醇20ml，加热回流1小时，滤过，滤 液蒸干，残渣加水20ml使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次20ml，合并正丁醇液， 先用氨试液50ml洗涤，再用正丁醇饱和的水洗涤2次，每次50ml，正丁醇液蒸干，残渣加甲 醇lml使溶解，作为供试品溶液；另取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每lml含0. lmg的溶液， 作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5 μ 1，分别点于同一硅胶G薄层 板上，以体积比13 :7 :2的三氯甲烷-甲醇-水在1(TC以下放置的下层溶液为展开剂，展 开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105°C加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对 照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点； (2) 骨碎补的薄层鉴别：取芪骨胶囊内容物1. 5g，加正丁醇20ml，加热回流1小时，滤 过，滤液蒸干，残渣加甲醇lml使溶解，作为供试品溶液；另取柚皮苷对照品，加甲醇制成每 lml含lmg的溶液，作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各2 μ 1，分别点 于同一硅胶G薄层板上，以体积比10 :2 :3的乙酸乙酯-甲酸-水的上层溶液为展开剂，展 开，取出，晾干，喷以1%三氯化铝乙醇溶液，105°C加热至斑点清晰，置365nm紫外光灯下检 视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点； (3) 肉苁蓉的薄层鉴别：取芪骨胶囊内容物2. 0g，加甲醇25ml，超声处理15分钟，滤 过，滤液浓缩至近干，残渣加甲醇3ml溶解，作为供试品溶液；另取松果菊苷对照品适量，加 甲醇制成每lml含lmg的对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各2μ1，分别 点于同一聚酰胺薄膜上，以体积比2 :1 :7甲醇-醋酸-水为展开剂，展开，取出，晾干，置 365nm紫外灯下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑 占 . 含量检测采用高效液相色谱法测定，其过程如下， (1) 色谱条件与系统适用性试验，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以体积比为45 : 50 :5的甲醇-水-冰醋酸为流动相，检测波长270nm，理论板数按淫羊藿苷峰计算应不低于 1500 ； (2) 对照品溶液的制备，精密称取淫羊藿苷对照品适量，加甲醇制成每lml含20μ g的 溶液，即得； (3) 供试品溶液的制备，取芪骨胶囊内容物约0. 15g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密 加入甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重 量，摇匀，滤过，取续滤液，即得； (4) 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μ 1，注入液相色谱仪，计算，即得，每 粒芪骨胶囊含淫羊藿以淫羊藿苷计，不得少于1. 〇mg。
【文档编号】G01N30/90GK105842381SQ201510017536
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2015年1月14日
【发明人】南淑华, 赖志成, 徐德生, 阳丽华, 史万忠, 车莉, 廖根杰, 杨惠婉, 倪嘉纳
【申请人】厦门中药厂有限公司