基于上转换发光技术的联合定量检测uNGAL和uCr的装置及其制备方法

基于上转换发光技术的联合定量检测uNGAL和uCr的装置及其制备方法
【专利摘要】一种基于上转换发光技术(UPT)的联合定量检测疾病标志物尿中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白(uNGAL)和尿液稀释影响纠正因子尿肌酐(uCr)的免疫层析装置及其制备方法，属于免疫检测技术领域。由样品稀释液冻干粉、NGAL和Cr标准品冻干粉、免疫层析试纸条组成；免疫层析试纸条由衬板、样品垫或UCP结合垫、分析膜及吸收垫组成；分析膜上设有平行的两个检测线T1、T2和一个质控线C，两个检测线T1、T2分别包被抗NGAL抗体和抗Cr抗体，质控线包被抗UCP标记抗体来源动物免疫球蛋白的抗体，所述试纸条可使用UCP读数仪定量uNGAL和uCr。本发明可联合定量不同分子形式uNGAL和uCr，具有快速、简便等优点。uNGAL经uCr纠正后可提高NGAL早期诊断肾损伤等疾病的能力，因此具有极大的科研和临床应用价值。
【专利说明】
基于上转换发光技术的联合定量检测uNGAL和uCr的装置及其 制备方法
技术领域
[0001] 本发明属于免疫学检测技术领域，具体涉及基于上转换发光技术(UPT)的联合定 量检测疾病生物标志物尿中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白（UNGAL)和尿液稀释影响纠正因 子尿肌酐(uCr)的免疫层析装置及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（neutrophil gelatinase associated lipocalin，NGAL)又称人中性粒细胞脂质运载蛋白（human neutrophil lipocalin，HNL)是 90年代初在中性粒细胞第二颗粒中发现的一种糖蛋白，属脂质运载蛋白（Iipocalin)超家 族成员，和其他脂质运载蛋白具有相似空间结构（J. Biol. Chem. 1993,268:10425-10432; Scand · J · Cl in · Lab · Invest · 1994，54:365-376) C3NGAL以单体、同二聚体及与MMP9形成异二 聚体等多种分子形式存在，不同分子形式NGAL与不同的病理过程具有差异相关性。其中单 体NGAL与肾小管急性损伤有相对较高的相关性，而同二聚体NGAL能有效反映尿道感染和细 菌感染情况。除中性粒细胞能分泌NGAL外，在生理条件下NGAL在人多种组织有表达但表达 水平低；在病理条件下如炎症、感染、肿瘤、缺血等，NGAL可在多种组织中上调表达 (Histochem.J.1999,31:433-441；Mol.Med.Rep.2012,6:716-722)〇
[0003] 近20多年来，NGAL作为急性细菌感染、肿瘤、肾功能损伤等疾病的标志物受到人们 的关注。特别是NGAL作为肾功能损伤的早期诊断生物标志物越来越受到人们重视。目前有 血清、血浆及尿NGAL用于肾功能损伤的早期诊断的报道。与临床现在采用的血清肌酐（sCr) 相比，NGAL在早期诊断肾功能损伤时表现出优异性能。已报道NGAL在早期诊断因缺血 (J.Endourol. 2013,27:1510-1515)、抗肿瘤药物顺铂(Am. J.Nephrol .2004,24:307-315)、 脓毒症(BiomecLRes · Int · 2015，2009，186:48-51;中国实用医药2015，24:46-47)、心脏外科 手术(Lancet 2005,365:1231-1238;Clin.Chim.Acta.2009,403:121-125)等引起的急性肾 功能损伤(AKI)时，比sCr提前1到2天预判患者是否将发生AKI，这为临床介入治疗AKI争取 到了宝贵时间。
[0004] 与血清和血浆NGAL相比，尿NGAL(uNGAL)用作诊断AKI的生物标志物尤其吸引人们 的注意力，主要原因有以下三点:第一，动物模型和体外细胞培养研究结果表明急性肾损伤 时肾小管上皮细胞上调表达NGAL而尿液又直接与病变部位接触，因此uNGAL能直接迅速反 映肾损伤情况;第二，尿液取样方式为非侵袭性，容易得到患者的配合，是最容易获得的体 液样本;第三，目前尿液检查是判断肾脏疾病的一种最常见的必须的检查项目。另一方面， 虽然uNGAL作为肾功能生物标志物有其自身独特的优点，但是尿液中NGAL的浓度受患者饮 水、静脉点滴注射药物等因素导致的尿液稀释影响，从而不能十分有效的反映真实的尿 NGAL浓度的动态变化情况，因此需要对因尿液稀释而导致的影响进行纠正。目前在临床上， uCr水平用于纠正尿液稀释对尿中检测物浓度带来的影响由来已久。肌酐(Cr)是肌肉里磷 酸肌酐的代谢产物，机体通常以恒定的速率产生;此外，肌酐是小分子物质，可自由通过肾 小球滤过且在肾小管内很少或不被重吸收。因此，机体每日产生的肌酐几乎全部随尿排出， uCr的日排出量很稳定，基本不受食物蛋白质含量和尿量的影响。所以可以通过测定uCr水 平来纠正尿液因稀释对uNGAL浓度动态变化的影响。
[0005] 目前实验室研究和临床应用虽然有单独分别测试NGAL和uCr的方法，但至今没有 在同一样本同时联合检测这两种标志物的方法和装置的报道。而将来NGAL有可能成为AKI 临床即时就地检验(Point of Care Testing，P0CT)项目。因此，设计和开发uNGAL和uCr联 合定量方法和装备具有巨大的实验室科学研究和将来临床应用需求。
[0006] NGAL定量方法有RIA(国际专利W0/1995/029404A1 和中国ZL 200980155194等）、 ELISA(欧洲专利EP 2225268和中国专利ZL200980155194等）、Western-blotting、胶乳免疫 比浊法（中国专利ZL 201410431 182 )、化学发光免疫分析法（中国专利申请号 201510184818)等。以上各种NGAL定量方法有各自优点和用途，但也存在一些缺点。对NGAL 检测需求来讲，最显著的缺点是检测周期长，很难满足用于POCT检测项目要求。免疫层析技 术是一种快速诊断方法，常用于POCT项目。近年来发展的NGAL免疫层析技术（中国专利 21^201220323587、21^01420423962、21^201220392399、21^01220323586和21^201220497401) 可以缩短检测时间。以上公开的NGAL免疫层析技术虽然具有操作方便和检测快速等优点， 但各种报告分子自身固有的缺点限制了相关产品的性能。如荧光免疫层析因荧光染料易发 生淬灭而导致产品稳定性差；荧光乳胶颗粒因其采用的荧光染料系物理掺杂而成，容易发 生泄漏，另外该类材料易发生非特异性吸附从而导致信噪比低问题;免疫胶体金技术采用 物理吸附的方法使标记物和报告分子结合，因物理吸附力弱标记物容易从报告分子金纳米 颗粒表面脱落而影响检测性能。近年来，以稀土金属元素掺杂于晶体的晶格中而构成的上 转换发光材料(up-converting phosphor，UCP)为报告分子的免疫层析上转换发光技术 (up-converting phosphor technology，UPT)是目前临床POCT检测领域的一个研究开发重 点和热点。UCP由主基质（host matrix)、吸收子(absorber)和发射子（emitter)三部分组 成，具有上转发光现象即在红外光激发下发射可见光。UCP产生的信号可以由UCP读数仪读 取。由于该种材料为人工合成且在自然界和体内并没有类似物质存在，因此无背景干扰问 题;此外，UCP还具有稳定性好、无悴灭、环境友好和生物相容性好等优异性能，该材料作为 示踪剂已应用于多种POCT检测系统中。中国专利(ZL201220497401)公开了一种NGAL检测的 上转发光快速定量装置，该技术部分克服了目前NGAL检测技术的不足，但是该技术并没有 考虑因尿液稀释而影响NGAL定量从而影响NGAL诊断肾功能损伤能力这一事实;此外该公开 的技术并没有考虑不同分子形式NGAL在诊断疾病时临床表现的差异。因此ZL201220497401 只是一种测定NGAL浓度的方法，并不能确定其测定的uNGAL是否真实反映 uNGAL动态变化情 况和不能区分测定不同分子形式的NGAL，从而限制了 uNGAL作为肾功能损伤标志物的能力 进而限制了该方法未来的临床应用。
[0007] uCr定量方法主要有基于肌酐脱亚胺酶和肌酐酶的酶法、基于肌酐与苦味酸盐作 用生成黄红色的苦味酸肌酐复合物的化学测定法(JafTe法)和基于肌酐在弱酸性环境中带 正电荷可通过阳离子交换层析柱分离的高效液相层析法等。酶法虽然具有特异性强灵敏度 高等优点，但酶的活性受很多因素影响从而影响该方法的稳定，而且成本比其他方法高。化 学测定法成本低廉，操作简便，是目前国内外测定肌酐最常用的方法之一。由于维生素 C、一 些抗生素如青霉素、丙酮、乙酰乙酸、及高浓度葡萄糖等物质也能与碱性苦味酸反应生成红 色产物，因此该方法的特异性不高。高效液相层析法测定uCr的精密度高、特异性好，但该法 对仪器设备要求高且操作复杂不适于大批量临床标本分析。目前肌酐的酶法和化学法能满 足临床单独对肌酐的测定，另外肌酐是小分子化合物，制备抗体比较困难;因此目前人们缺 乏开发基于抗原抗体反应的肌酐的免疫学测定方法和相应装备的动力。随着抗体制备技术 进步和发展，将小分子半抗原Cr与载体物质如血清白蛋白、卵清蛋白、匙孔蓝蛋白、羧甲基 纤维素及多聚赖氨酸等载体分子偶联构成完成抗原免疫动物获得相应抗Cr抗体已成现实。 由于免疫学检测技术具有特异性强、种类多等优点，建立和开发Cr免疫检测技术和装备是 未来该领域研究和开发的一个热点。但至今仍没有与本发明相关的技术方案公开。

【发明内容】

[0008]为了克服因尿液稀释导致的对uNGAL浓度动态变化的影响以及特异性检测不同分 子形式uNGAL的困难，本发明设计并开发出基于上转换发光技术的联合定量检测uNGAL和 uCr的装置及其制备方法，其中uCr用于纠正尿液稀释对uNGAL浓度的影响。本发明可在同一 样本同步联合测定uNGAL和uCr的浓度，此外还可以定量不同分子形式uNGAL，具有样品前处 理简单、样品用量少、检测过程方便和快速、灵敏度和特异性高等优点。在肾功能损伤及其 他疾病如急性细菌感染等早期诊断实验室研究和临床检验领域有极大应用潜力。
[0009 ]为了实现上述目标，本发明采取如下技术方案：
[0010] 基于上转换发光技术的联合定量检测uNGAL和uCr装置，由样品稀释液冻干粉、 NGAL和Cr标准品冻干粉、免疫层析试纸条组成，其中免疫层析试纸条由衬板、样品垫或UCP 结合垫、含两条检测线和一条质控线的分析膜和吸收垫组成。所述衬板用于支撑样品垫或 UCP结合垫、分析膜和吸收垫的组装，所述UCP结合垫用于结合UCP标记抗NGAL体和UCP标记 Cr，所述分析膜用于检测线和质控线的设置从而实现NGAL和Cr的定量及免疫层析试纸条的 质控，所述吸收垫用于收集分析后的样品溶液。1)所述样品稀释液冻干粉
[0011] 制备方法如下：将20mL、pH = 7.2~7.5,含 150~250mmol/L NaCl、0.25~0.5% (vol/vol )Tween_20、0.5% ~2%(wt/vol )BSA 或 2.5% ~5%(wt/vol)脱脂奶粉的 50 ~ lOOmmol/L HEPES缓冲液经机械或磁力搅拌充分后，采用0 · 22μπι或0 · 45μπι滤器进行过滤除 菌和除去不溶性杂质，经冻干后室温保存。
[0012] 样品稀释液冻干粉使用前加入20mL去离子水充分溶解后获得样品稀释液。
[0013 ] 2)所述NGAL和Cr标准品冻干粉共4套
[0014] a)标准品A:是用于单体uNGAL和uCr测定的标准品，每管含60ng单体NGAL和6μL?〇1 Cr;制备方法是将60ng单体NGAL和6μηιο1 Cr溶于300yL、pH = 7 · 4且含5~10%海藻糖(界1:/ V01)的I3BS溶液中得到的含200ng/mL单体NGAL和20mmo I/L Cr的溶液，过滤除菌后采用常规 方法冻干后室温保存。
[0015] b)标准品B:用于同二聚体uNGAL和uCr测定的标准品，每管含60ng同二聚体NGAL和 6ymol Cr;制备方法是将60ng同二聚体NGAL和6μπιο1 Cr溶于300yL、pH=7.4且含5~10%海 藻糖(wt/vol)的I3BS溶液得到的含200ng/mL同二聚体NGAL和20mmol/L Cr的溶液，过滤除菌 后采用常规方法冻干后室温保存。
[0016] c)标准品C:用于异二聚uNGAL和uCr测定的标准品，每管含60ng异二聚体NGAL和6μ molCr;制备方法是将60ng异二聚体NGAL和6μπιο1 Cr溶于300yL、pH = 7.4且含5~10%海藻 糖(wt/vol)的I3BS溶液得到的含200ng/mL异二聚体NGAL和20mmol/L Cr的溶液，过滤除菌后 采用常规方法冻干后室温保存。
[0017] d)标准品D:用于三种分子形式uNGAL和uCr测定的标准品，每管含60ng NGAL(其中 单体NGAL、同二聚体NGAL及异二聚体NGAL各占40 %、40 %和20 % )和6μπιο1 Cr;制备方法是 将24ng单体NGAL、24ng同二聚体NGAL、12ng异二聚体NGAL和6ymol Cr溶于300yL、pH=7.4且 含5~10 %海藻糖(wt/vol)的I3BS溶液得到的含200ng/mL NGAL(其中单体NGAL、同二聚体 NGAL及异二聚体NGAL各占40%、40%和20%)和20mmoI/L Cr的溶液，过滤除菌后采用常规 方法冻干后室温保存。
[0018] 以上标准品使用前加入去离子水300yL混匀制备成标准品工作液。根据实验室研 究和临床研究的不同目的选择使用以上4套标准品中的一套或多套。使用时将以上标准品 工作液用样品稀释液进行2倍稀释法进行稀释，用于标准曲线的制定。
[0019] NGAL和Cr标准品采用本领域常规技术制备和/或通过商业途径获得。单体NGAL标 准品利用原核表达载体和真核表达载体在相应宿主细胞表达纯化获得或为商品化的NGAL (Biochem.Biophys .Res.Commun · 1994，202:1468-1475;Abcam的ab 188461)。同二聚体NGAL 和异二聚体NGAL从人血液中分离获得，具体是将血液血沉棕黄层自然沉降去除红细胞后获 得粒细胞，粒细胞经氮气空化破碎获得粒细胞颗粒，然后酸裂解颗粒后进行分离纯化 (Scand .J. Clin .Lab .Invest · 1994,54:365-376) <Xr(CAS 号 60-27-5)为商品化产品（如 Sigma公司的C4255或其他公司类似商品），纯度应大于等于98 %。
[0020] 3)所述免疫层析试纸条的报告分子为UCP，UCP粒径为200~600nm，UCP分别标记在 抗NGAL或标记在Cr上。
[0021] UCP标记抗NGAL包括UCP标记抗单体NGAL抗体、UCP标记抗同二聚体NGAL抗体、UCP 标记抗MMP-9抗体或UCP标记抗上述三种分子形式NGAL抗体。
[0022] 上述UCP标记抗NGAL或标记Cr通过共价键偶联实现，偶联方法为常规的已公开的 技术。UCP与抗体分子通过本领域常规的偶联方式形成UCP标记抗体(Anal .Biochem. 2001， 293:307-318; J · Clin .Micro · 2008，46:171-187) WCP与Cr分子通过本领域常规的偶联方式 形成UCP标记Cr分子，如先将UCP进行3-氨基丙基-三甲氧基硅烷(APTMS)修饰然后采用双功 能连接分子戊二醛做交联剂实现Cr与UCP共价结合。
[0023] 将 UCP 标记抗 NGAL 抗体和 UCP 标记 Cr 溶于含有 0.05%(vol/vol)Triton-100、0.1% (wt/vol )NaN3、pH = 8.0的50mmol/L甘氨酸缓冲液中，UCP标记抗NGAL的浓度为lmg/mL，UCP 标记Cr的浓度为10mol/L。
[0024] 4)所述免疫层析试纸条分A和B两类，每类数量根据实际需求可设定不同规格。
[0025] a)A类免疫层析试纸条：由衬板、样品垫、分析膜及吸收垫组成，进一步可以由塑料 外壳封装。A类免疫层析试纸条额外配备UCP标记抗NGAL抗体溶液和UCP标记Cr溶液组成的 混合溶液(每100个A类免疫层析试纸条配备IOyL的UCP标记抗NGAL抗体溶液和UCP标记Cr溶 液组成的混合溶液），使用前将上述混合溶液用样品稀释液稀释200~500倍。
[0026] A类免疫层析试纸条的使用方法如下:首先将标准品工作液用样品稀释液进行2倍 梯度稀释法进行稀释，获得标准品浓度梯度溶液;接着将尿液样品用样品稀释液稀释10~ 100倍;取25~I OOyL上述标准品浓度梯度溶液或尿液样品稀释液复孔加入相应的96孔板的 孔中或类似结构的容器当中；然后在上述96孔板中再各加入25~IOOyL经稀释的UCP标记抗 NGAL抗体溶液和UCP标记Cr溶液组成的混合溶液，混匀制成悬液;接着将A类免疫层析试纸 条的样品垫端垂直浸入上述悬液中，等待5~30min后取出水平放置5~20min后进行UCP信 号米集。
[0027] b)B类免疫层析试纸条：由衬板、UCP结合垫、分析膜及吸收垫组成，进一步可以由 塑料外壳封装。UCP结合垫中含有UCP标记抗NGAL抗体和UCP标记Cr，具体制备方法是按 0.5mL/cm 2的用量将UCP标记抗NGAL抗体溶液和UCP标记Cr溶液组成的混合溶液均匀滴加在 UCP结合垫上，30 °C~35 °C干燥后制得。
[0028] B类免疫层析试纸条的使用方法如下：将免疫试纸条水平放置后，加20~IOOyL的 标准品浓度梯度溶液或尿液样品稀释液至UCP结合垫上，等待10~30min后进行UCP信号采 集。
[0029]以上A、B两类免疫层析试纸条的样品垫或UCP结合垫、分析膜、吸收垫及衬板的宽 度一致，均为4~5.5mm，样品垫和UCP结合垫的长度为5~10mm，分析膜的长度为25~40mm， 吸收垫的长度为20~30mm，衬板的长度等于前后搭接组装后样品垫或UCP结合垫、分析膜及 吸收垫的长度总和;其中样品垫和UCP结合垫的材料为玻璃纤维素膜或具有类似性质的膜 材料，分析膜的材料为硝酸纤维素膜或具有类似性质的膜材料，吸收垫的材料为吸水滤纸 或具有类似功能的材料，衬板的材料为具有自粘贴性质聚氯乙烯胶板或具有类似功能的材 料。
[0030] UCP免疫层析试纸条的组装方式采用本领常规技术方法实现。
[0031] UCP为通过本领域常规技术在实验室合成的或商品化的平均粒径为200~ 600nmol/L的经二氧化娃包被和表面功能化修饰的由稀土金属元素所构成的晶体材料(如 NaYF4：Er,Yb)〇
[0032] 5)所述分析膜上设有平行的两个检测线(Tl和T2)和一个质控线(C)，所述两个检 测线T1和T2分别包被抗NGAL抗体和抗Cr抗体，且两者可以相互对调。UCP结合垫中含有的 UCP标记的抗NGAL抗体与分析膜包被的抗NGAL抗体识别NGAL不同表位，所述的抗NGAL抗体 针对的抗原为人源NGAL，所述人源NGAL为单体、同二聚体、异二聚体或三者的混合物，所述 UCP标记Cr和尿液样品的uCr能竞争性与分析膜包被的抗Cr抗体结合，所述质控线包被抗 UCP标记抗体来源动物免疫球蛋白的抗体。所述试纸条可用UCP读数仪进行数据采集。
[0033] 进一步地，检测线Tl离样品垫或UCP结合垫末端5~10mm、Tl、T2及C之间的间隔为5 ~IOmm;其中Tl包被抗NGAL抗体，而T2包被抗Cr抗体或者Tl包被抗Cr抗体而T2包被抗NGAL 抗体，质控线C包被抗UCP标记抗体来源动物免疫球蛋白的抗体;包被方法是利用手工方法 或专用的点样仪在分析膜上（从UCP结合垫往吸收垫方向）依次均匀喷涂抗NGAL抗体溶液、 抗Cr抗体溶液及抗UCP标记抗体来源动物免疫球蛋白的抗体;抗体溶液是将抗体溶于抗体 缓冲液后得到，抗体浓度为lmg/mL，抗体缓冲液为含1 % (voI/vo 1)甲醇、pH = 8.0的IOOmM Tris-HCL溶液液;最终喷涂量为0.025~0.05mL/mm，相当于每毫米Tl、T2或C线喷涂25ng~ 50ng抗体;室温晾干后可长期室温保存(至少12个月内产品性能没有显著改变）。
[0034]抗NGAL抗体、抗Cr抗体以及质控线抗体利用本领域常规技术制备或通过商业渠道 购买获得。抗NGAL抗体为商品化的抗体或以NGAL为抗原通过常规抗体制备技术制备的抗 NGAL抗体（Current protocols in molecular biology. New York: John Wiley, 2008 11.10.1-11.10.10 41^3111公司的3匕23477、3匕70287、313188551等）；以上方法制备或购买的 抗体经单体、同二聚体或异二聚体NGAL抗原筛选获得针对特定分子形式NGAL的抗体。抗Cr 抗体的获得途径:将Cr半抗原经与载体如血清白蛋白、卵清蛋白、匙孔蓝蛋白、羧甲基纤维 素及多聚赖氨酸等载体分子通过常规技术偶联构成完成抗原免疫动物获得相应抗Cr抗体 或经商业渠道购买(如Creative Diagnostics公司或其他公司均有该类产品出售），抗Cr抗 体可与游离的Cr和UCP标记的Cr结合。质控线包被的抗体根据UCP标记抗体类型决定，可为 兔抗鼠 IgG抗体或羊抗鼠 IgG抗体或其他动物来源的抗鼠 IgG抗体或抗兔IgG抗体等，由商业 渠道购买获得(如abeam公司相应抗体产品）。
[0035]由于采取了以上技术方案，使本发明具有显著有益效果。
[0036]目前没有联合检测uNGAL和uCr技术，与最接近的现有技术(ZL201220497401)相 比，本发明具有以下两方面创造性:第一，基于因尿液稀释影响单独测定uNGAL不能有效反 映该生物标志物的动态变换情况而测定uNGAL的动态变化是预判肾功能损伤的最重要途径 这一基本理论和事实，本发明创造性的引进并在同一样本实现同时联合测定uNGAL和尿液 稀释的纠正因子uCr，而ZL201220497401只是公布了一种基于UPT的NGAL测定方法并没有涉 及uCr;第二，本发明可以用来测定全部分子形式uNGAL也可以用来测定单体或同二聚体或 异二聚体uNGAL，ZL201220497401所测定的NGAL的分子形式并不明确，而不同NGAL的分子形 式与其作为不同病理的诊断生物标志物的临床表现具有显著相关性 (Clin.J.Am.Soc.Nephrol.2010,12:2229-2235)〇
[0037] 此外，本发明还在以下三方面具有创造性:第一，将双抗体夹心免疫检测技术和单 抗体竞争免疫检测技术应用于同一测试体系，从而实现对大分子蛋白质(NGAL)和小分子化 合物(Cr)的联合定量。第二，采用免疫学方法测定Cr浓度，丰富了目前Cr浓度的测定方法。 第三，采用UCP免疫层析技术可使NGAL和Cr的浓度测定在短时间内完成(本发明装置可以在 30~70min钟内完成测试，而常规的ELISA需要3~5h)，从而使NGAL可用于临床POCT项目检 测 。
[0038] 综上，本发明不存在对现有技术进行改进的动机且要求保护的技术方案并非显而 易见的，并且要求保护的技术方案能够产生显著的有益的效果，因此是一具有新颖性和创 造性的发明创造。
【附图说明】
[0039] 图1为本发明基于上转换发光技术的联合定量检测uNGAL和uCr装置中A类免疫层 析试纸条的剖面示意图。其中1样品垫、2为分析膜、3为吸收垫、4为衬板、5和6为检测线Tl和 T2(其中Tl包被抗NGAL抗体而T2包被抗Cr抗体，或者Tl包被抗Cr抗体而T2包被抗NGAL抗 体）、7为质控线C(包被抗UCP标记抗体来源动物免疫球蛋白的抗体，根据UCP标记抗体的种 类决定）。
[0040] 图2为本发明基于上转换发光技术的联合定量检测NGAL和尿肌酐装置中B类免疫 层析试纸条的剖面示意图。其中21为UCP结合垫(包被UCP标记的抗体和UCP标记的Cr，UCP标 记抗体可为UCP标记抗NGAL抗体或UCP标记在抗MMP9抗体，UCP标记抗NGAL抗体可为UCP标记 的抗单体NGAL抗体、UCP标记的抗同二聚体NGAL抗体或UCP标记的抗上述三种分子形式NGAL 的抗体）、2为分析膜、3为吸收垫、4为衬板、5和6为检测线Tl和T2 (其中T1包被抗NGAL抗体， 而T2包被抗Cr抗体或者Tl包被抗Cr抗体而T2包被抗NGAL抗体）、7为质控线C(包被抗UCP标 记抗体来源动物免疫球蛋白的抗体，根据UCP标记抗体的种类决定）。
[0041] 图3为本发明基于上转换发光技术的联合定量检测uNGAL和uCr装置中A类免疫层 析试纸条配套的试纸条放置架示意图。放置架为一空心、底面缺失的长方体，长和宽尺寸略 大于标准96孔板的尺寸(如长为130mm、宽为87mm)，高度为40mm~50mm;材质为塑料或纸类； 其中31为放置架顶面其上有与96孔板对应的长方形孔(长方形孔的尺寸以略大于A类免疫 层析试纸条的宽度和厚度为准），32为放置架侧面，33为放置架前面，34为放置架顶面的试 纸条放置孔。
[0042] 图4为实施例3基于上转换发光技术联合定量检测总uNGAL和uCr装置的制备及使 用方法的标准曲线。图4左图是根据表1uNGAL峰面积AUCl和AUC2的平均值与总NGAL标准品 浓度绘制的标准曲线，用于尿液样品中总uNGAL的计算；图4右图是根据表2uCr峰面积AUCl 和AUC2的平均值与Cr标准品浓度绘制的标准曲线，用于尿液样品中uCr的计算。
[0043] 图5为实施例4基于上转换发光技术的联合定量检测uNGAL和uCr装置联合检测单 体uNGAL和uCr浓度的标准曲线。图5左图是根据表2uNGAL峰面积AUCl和AUC2的平均值与单 体NGAL标准品浓度绘制的标准曲线，用于尿液样品中单体uNGAL的计算；图5右图是根据表 2uCr峰面积AUCl和AUC2的平均值与Cr标准品浓度绘制的标准曲线，用于尿液样品中uCr的 计算。
[0044] 图6为实施例5基于上转换发光技术的联合定量检测uNGAL和uCr装置联合检测异 二聚体uNGAL和uCr浓度的标准曲线图。图6左图是根据表3uNGAL峰面积AUCl和AUC2的平均 值与异二聚体NGAL标准品浓度绘制的标准曲线，用于尿液样品中异二聚体uNGAL的计算；图 6右图是根据表4uCr峰面积AUCl和AUC2的平均值与Cr标准品浓度绘制的标准曲线，用于尿 液样品中uCr的计算。
【具体实施方式】
[0045] 下面将用实施例进一步说明本发明。本发明实施例是用于本发明的进一步解释而 不是对本发明的限定。根据本发明的实质进行的具体改进都属于本发明要求保护的范围。
[0046] 实施例1:基于上转换发光技术联合定量检测总uNGAL和uCr装置组成
[0047] 1)样品稀释液冻干粉1份(试剂I)
[0048] 2)标准品D溶液冻干粉1管(试剂Π )
[0049] 3) UCP标记抗三种分子形式NGAL抗体和UCP标记Cr溶液1管(试剂ΙΠ )
[0050] 4)A类免疫层析试纸条96根
[0051] 5)A类免疫层析试纸条配套试纸条放置架1个
[0052] 6) 96孔板1块，96孔板封板膜一张
[0053] 实施例2:基于上转换发光技术联合定量检测总NGAL和尿肌酐装置组成
[0054] 1)样品稀释液冻干粉1份(试剂I)
[0055] 2)标准品D溶液冻干粉1管(试剂Π )
[0056] 3)B类免疫层析试纸条100根
[0057]实施例3:-种基于上转换发光技术联合定量检测总uNGAL和uCr装置的制备及使 用方法
[0058] 1)装置的制备
[0059] a)样品稀释液冻干粉(试剂I)配制
[0060] 样品稀释液 20mL，由 lOOmmol/L HEPES，pH 7.2,200mmol/L NaCl，0.25%(vol/ vol )Tween_20，0.5% (wt/vol)的BSA组成;经磁力搅拌充分后，采用0.45μηι滤器进行过滤除 菌和除去不溶性杂质后冻干;室温保存。
[0061 ] b)标准品D溶液冻干粉(试剂Π )配制
[0062] 由300yL含200ng/mL NGAL(单体、同二聚体及异二聚体NGAL各占40%、40%和 20% )、20mmol/L Cr及 10%海藻糖(wt/vol)的ρΗ=7·4的 10mmol/L PBS溶液经磁力搅拌充 分后，采用〇.22μπι滤器进行过滤除菌和除去不溶性杂质后冻干;室温保存。
[0063] c) UCP标记抗三种分子形式NGAL抗体和UCP标记Cr溶液1管(试剂ΙΠ )配制
[0064] UCP标记抗三种分子形式NGAL抗体和UCP标记Cr溶液10yL，溶液组成为50mM甘氨 酸、0.05 % Tri ton-100、0· I^NaN3、lmg/mL UCP标记的兔抗三种分子形式NGAL抗体 (Proteintech公司的22264-1-AP)和lOmol/mL UCP标记Cr的水溶液;4°C保存。
[0065] d)A类免疫层析试纸条96根制备
[0066] A类免疫层析试纸条由衬板、样品垫、分析膜及吸收垫组成;样品垫材料为玻璃纤 维素膜，分析膜材料为硝酸纤维素膜，吸收垫材料为吸水滤纸，衬板的材料为具有自粘贴性 质聚氯乙稀胶板。衬板、样品垫、分析膜及吸收垫的宽度均为4.5mm，长度分别为56mm、10mm、 30mm和20mm。分析膜上Tl、T2及C线分别喷涂含IOOng抗体的羊抗NGAL抗体溶液(Abeam公司 的abl 66677 )、羊抗Cr抗体(Abeam公司的ab30719)溶液及羊抗兔IgG抗体(Abeam公司的 ab97091)溶液。样品垫末端搭载在分析膜上，两者重合部位长度为2mm，分析膜后端搭载在 吸收垫下，两者重合部位长度为2mm;样品垫、分析膜及吸收垫依次组装在衬板上，室温保 存。
[0067] 上述所用羊抗NGAL抗体溶液、羊抗Cr抗体溶液及羊抗兔IgG抗体溶液按下述方法 制备:将抗NGAL抗体、抗Cr抗体或抗鼠 IgG抗体分别溶解在pH8.0的lOOmmol/L Tris-HCl、质 量分数为1 %的甲醇溶液中，抗体的溶度为lmg/mL。
[0068] 2)装置使用步骤
[0069] a)制备试剂I工作液:加20mL去离子水至试剂I容器中，涡旋震荡混匀备用。
[0070] b)取8个 1.5mL 离心管，标上号（如 50、51、52、53、54、55、56和57)。
[0071] c)在以上SO~S7离心管中各加入步骤a)制备的试剂I工作液150yL。
[0072] d)加300yL去离子水至试剂Π 容器中获得试剂Π 溶液，混匀后全部取出加入SO管； 然后从SO取出150yL加入Sl管;混匀后从Sl管取出150yL加入S2管;混匀后从S2管取出150yL 加入S3管;混匀后从S3管取出150yL加入S4管;混匀后从S4管取出150yL加入S5管;混匀后从 S5管取出150yL加入S6管;混匀S6管。
[0073 ] e)制备稀释后的样品溶液:临床尿液经离心（1000 Orpm、Imin)后利用试剂I工作液 作10~100倍数稀释，离心与否应根据实际尿样质量决定。
[0074] f)制备UCP标记抗体工作液
[0075] 往试剂m容器中加入4990yL试剂I工作液，水浴超声（20kHz，320W，每次超声15s， 停15s，一共3次;或类似超声强度）。
[0076] g)向96孔板的每孔加入50yL S0-S7溶液或50yL稀释后的样品溶液;然后再往每孔 中加入50yL UCP标记抗体工作液。
[0077] h)盖上封板膜后固定在96孔板摇床上，800rpm、37 °C下孵育30min。
[0078] i)去掉封板膜，将96孔板放置在免疫层析试纸条放置架下。
[0079] j)在每孔中依次插入A类免疫层析试纸条，等待20min。
[0080] k)取出A类免疫层析试纸条在UCP读数仪上进行数据采集 [0081 ] 1)绘制参考标准曲线
[0082] 表1为本实施例NGAL和Cr标准品溶液(SO~S6)及空白对照溶液(S7)不同浓度对应 的峰面积(AUC)。其中AUCl和AUC2是指一个浓度梯度标准品溶液或空白对照溶液的两个复 孔(平行孔)的AUC读数。
[0083] 表1:不同浓度标准品NGAL和Cr对应的UCP峰面积(AUC)读数
[0085]图4左图是根据表1的uNGAL峰面积AUCl和AUC2的平均值与NGAL标准品浓度绘制的 标准曲线；图4右图是根据表1的uCr峰面积AUCl和AUC2的平均值与Cr标准品浓度绘制的标 准曲线。
[0086]实施例4:基于上转换发光技术联合定量检测单体uNGAL和uCr装置的制备及使用 方法
[0087] 1)装置的制备
[0088] a)样品稀释液冻干粉(试剂I)配制
[0089] 样品稀释液 20mL，由 lOOmmol/L HEPES，pH 7.2,200mmol/L NaCl，0.25%(vol/ vol )Tween_20，0.5% (wt/vol)的BSA组成;经磁力搅拌充分后，采用0.45μηι滤器进行过滤除 菌和除去不溶性杂质后冻干;室温保存。
[0090] b)标准品A溶液冻干粉(试剂Π )配制
[0091 ]由300yL含200ng/mL单体NGAL和20mmol/L Cr 20mmol/L及 10%海藻糖(wt/vol)的 pH=7.4的lOmmol/L的PBS溶液经磁力搅拌充分后，采用0.22μπι滤器进行过滤除菌和除去不 溶性杂质后冻干;室温保存。
[0092] c) UCP标记抗单体NGAL抗体和UCP标记Cr溶液1管(试剂ΙΠ )配制
[0093] UCP标记抗单体NGAL抗体和UCP标记Cr溶液IOyL，该溶液组成为50mM甘氨酸、 0.05%1'1'；11:〇11-100、0.1%他^、111^/1111^1]0?标记的鼠抗单体呢厶1^单克隆抗体（13;[(^01'1:0 diagnostocsA/S公司的BW 009号产品）和lOmol/mL UCP标记的Cr的水溶液;4°C保存。
[0094] d)A类免疫层析试纸条96根制备
[0095] A类免疫层析试纸条由衬板、样品垫、分析膜及吸收垫组成;样品垫材料为玻璃纤 维素膜，分析膜材料为硝酸纤维素膜，吸收垫材料为吸水滤纸，衬板的材料为具有自粘贴性 质聚氯乙烯胶板或具有类似功能的材料。衬板、样品垫、分析膜及吸收垫的宽度均为4.5_， 长度分别为56mm、10mm、30mm和20mm。每条分析膜上ΤΙ、T2及C线分别喷涂含IOOng抗体的羊 抗NGAL抗体溶液(Abeam公司的ab 166677 )、羊抗Cr抗体(Abeam公司的ab30719)溶液及羊抗 鼠 IgG抗体(Abeam公司的ab6710)溶液。样品垫末端搭载在分析膜上，两者重合部位长度为 2mm，分析膜后端搭载在吸收垫下，两者重合部位长度为2mm;样品垫、分析膜及吸收垫依次 组装在衬板上，室温保存。
[0096] 上述所用羊抗NGAL抗体溶液、羊抗Cr抗体溶液及兔抗鼠IgG抗体溶液按下述方法 制备：将羊抗NGAL抗体、羊抗Cr抗体或兔抗鼠IgG抗体分别溶解在pH = 8.0的IOOmmo 1/L Tris-HCl、质量分数为1 %的甲醇溶液中，抗体的浓度为lmg/mL。
[0097] 2)装置使用步骤
[0098] a)制备试剂I工作液:加20mL去离子水至试剂I容器中，涡旋震荡混匀备用。
[0099] b)取8个 1.5mL 离心管，标上号（如 S0、S1、S2、S3、S4、S5、S6&S7)。
[0100] c)在以上SO~S7离心管中各加入步骤a)制备的试剂I工作液150yL。
[0101] d)加300yL去离子水至试剂Π 容器中获得试剂Π 溶液，混匀后全部取出加入SO管； 然后从SO取出150yL加入Sl管;混匀后从Sl管取出150yL加入S2管;混匀后从S2管取出150yL 加入S3管;混匀后从S3管取出150yL加入S4管;混匀后从S4管取出150yL加入S5管;混匀后从 S5管取出150yL加入S6管;混匀S6管。
[0102 ] e)制备稀释后的样品溶液:临床尿液经离心（1000 Orpm、Imin)后利用试剂I工作液 作10~100倍数稀释，离心与否应根据实际尿样质量决定。
[0103] f)制备UCP标记抗体工作液
[0104] 往试剂m容器中加入4990yL试剂I工作液，水浴超声（20kHz，320W，每次超声15s， 停15s，一共3次;或类似超声强度）。
[0105] g)向96孔板的每孔加入50yL S0-S7溶液或50yL稀释后的样品溶液;然后再往每孔 中加入50yL UCP标记抗体工作液。
[0? 06] h)盖上封板膜后固定在96孔板摇床上，800rpm、37 °C下孵育30min。
[0107] i)去掉封板膜，将96孔板放置在免疫层析试纸条放置架下。
[0108] j)在每孔中依次插入A类免疫层析试纸条，等待20min。
[0109] k)取出A类免疫层析试纸条在UCP读数仪上进行数据采集。
[0110] 1)绘制参考标准曲线。
[0111] 表2为本实施例NGAL和Cr标准品溶液(SO~S6)及空白对照溶液(S7)不同浓度对应 的峰面积(AUC)。其中AUCl和AUC2是指一个浓度梯度标准品溶液或空白对照溶液的两个复 孔(平行孔)的AUC读数。
[0112] 表2:不同浓度标准品单体NGAL和Cr对应的UCP峰面积(AUC)读数
[0114] 图5左图是根据表2的uNGAL峰面积AUCl和AUC2的平均值与单体NGAL标准品浓度绘 制的标准曲线；图5右图是根据表2的uCr峰面积AUCl和AUC2的平均值与Cr标准品浓度绘制 的标准曲线。
[0115] 实施例5:基于上转换发光技术联合定量检测异二聚体uNGAL和uCr剂盒的制备及 使用方法
[0116] 1)装置的制备
[0117] a)样品稀释液冻干粉(试剂I)配制
[0118] 样品稀释液 20mL，由 lOOmmol/L HEPES，pH 7.2,200mmol/L NaCl，0.25%(vol/ vol )Tween_20，0.5% (wt/vol)的BSA组成;经磁力搅拌充分后，采用0.45μηι滤器进行过滤除 菌和除去不溶性杂质后冻干;室温保存。
[0119] b)标准品C溶液冻干粉(试剂Π )配制
[0120]由 300yL含200ng/mL异二聚体NGAL和20mmol/L Cr、20mmol/L及 10 %海藻糖（wt/ vol)的pH=7.4的lOmmol/L的PBS溶液经磁力搅拌充分后，采用0.22μηι滤器进行过滤除菌和 除去不溶性杂质后冻干;室温保存。
[0121] e)B类免疫层析试纸条96根(该实施例所用试纸条有塑料外壳)制备
[0122] B类免疫层析试纸条衬板、UCP结合垫、分析膜及吸收垫组成;UCP结合垫材料为玻 璃纤维素膜，分析膜材料为硝酸纤维素膜，吸收垫材料为吸水滤纸，衬板的材料为具有自粘 贴性质聚氯乙烯胶板或具有类似功能的材料。衬板、UCP结合垫、分析膜及吸收垫的宽度均 为4mm，长度分别为56mm、10mm、10mm、30mm和20mm。结合垫含有UCP标记的兔抗MMP9抗体 (Abeam公司的ab38898)和UCP标记的Cr;具体制备方法是按0.5mL/cm 2的量将浓度为lmg/mL 的UCP标记的兔抗MMP-9抗体溶液和I Omo I /L的UCP标记的Cr溶液均匀加在UCP垫上，35 °C干 燥后制得。每条分析膜上Tl、T2及C线分别喷涂含IOOng抗体的羊抗NGAL抗体(Abeam公司的 ab 166677)溶液、羊抗Cr抗体(Abeam公司的ab30719)的溶液及羊抗兔IgG抗体(Abeam公司的 ab97091)溶液。UCP结合垫搭载在分析膜上，两者重合部位长度为2mm;分析膜后端搭载在吸 收垫下，两者重合部位长度为2_。样品垫、分析膜及吸收垫依次组装在衬板上。室温保存。
[0123] 上述所用羊抗NGAL抗体溶液、羊抗Cr抗体溶液及羊抗兔IgG抗体溶液按下述方法 制备：将羊抗NGAL抗体、羊抗Cr抗体或羊抗鼠 IgG抗体分别溶解在pH = 8.0的IOOmmo 1/L Tris-HCl、质量分数为1 %的甲醇溶液中，抗体的溶度为lmg/mL。
[0124] 2)装置使用步骤
[0125] a)制备试剂I工作液:加20mL去离子水至试剂I容器中，涡旋震荡混匀备用。
[0126] b)取8个 1.5mL 离心管，标上号（如 S0、S1、S2、S3、S4、S5、S6&S7)。
[0127] c)在以上SO~S7离心管中各加入步骤a)制备的试剂I工作液150yL。
[0128] d)加 300yL去离子水至试剂Π容器中获得试剂Π溶液，混匀后全部取出加入SO管； 然后从SO取出150yL加入Sl管;混匀后从Sl管取出150yL加入S2管;混匀后从S2管取出150yL 加入S3管;混匀后从S3管取出150yL加入S4管;混匀后从S4管取出150yL加入S5管;混匀后从 S5管取出150yL加入S6管;混匀S6管。
[0129 ] e)制备稀释后的样品溶液:临床尿液经离心（1000 Orpm、Imin)后利用试剂I工作液 作10~100倍数稀释，离心与否应根据实际尿样质量决定。
[0130] f)将B类免疫试纸条水平放置在桌面上，在UCP结合垫上加入IOOyL S0-S7溶液或 经稀释后的样品溶液，等待20min;
[0131] g)在UCP读数仪上进行数据采集；
[0132] h)绘制参考标准曲线。
[0133] 表2为本实施例NGAL和Cr标准品溶液(SO~S6)及空白对照溶液(S7)不同浓度对应 的峰面积(AUC)。其中AUCl和AUC2是指一个浓度梯度标准品溶液或空白对照溶液的两个复 孔(平行孔)的AUC读数。
[0134] 表3:不同浓度标准品异二聚体NGAL和Cr对应的UCP峰面积(AUC)读数
[0136]图6左图是根据表3的uNGAL峰面积AUCl和AUC2的平均值与异二聚体NGAL标准品浓 度绘制的标准曲线；图6右图是根据表3的uCr峰面积AUCl和AUC2的平均值与Cr标准品浓度 绘制的标准曲线。
【主权项】
1. 一种基于上转换发光技术的联合定量检测UNGAL和uCr装置，其特征在于：由样品稀 释液冻干粉、NGAL和Cr标准品冻干粉、免疫层析试纸条组成； (1)样品稀释液冻干粉是将20mL、pH = 7 · 2~7 · 5，含150~250mmol/L NaCl、0 · 25~ 0.5%(￥〇1八〇1)1?^611-20、0.5%~2%(￥1:八〇1)133厶或2.5%~5%(￥1:八〇1)脱脂奶粉的50 ~100mmol/L HEPES缓冲液经机械或磁力搅拌充分后，采用0.22μπι或0.45μπι滤器进行过滤 除菌和除去不溶性杂质，经冻干后得到； (2 )NGAL和Cr标准品冻干粉共4套，其中， 标准品A:是用于单体uNGAL和uCr测定的标准品，每管含60ng单体NGAL和6μηιο 1 Cr; 标准品B:用于同二聚体uNGAL和uCr测定的标准品，每管含60ng同二聚体NGAL和6μηιο1 Cr； 标准品C:用于异二聚uNGAL和uCr测定的标准品，每管含60ng异二聚体NGAL和6ymolCr; 标准品D:用于三种分子形式uNGAL和uCr测定的标准品，每管含60ng NGAL和6μηιο1 Cr， 其中单体NGAL、同二聚体NGAL及异二聚体NGAL各占40 %、40 %和20 % ; (3) 所述免疫层析试纸条分A和B两类，A类免疫层析试纸条由衬板、样品垫、分析膜及吸 收垫组成;B类免疫层析试纸条由衬板、UCP结合垫、分析膜及吸收垫组成;UCP结合垫中含有 UCP标记抗NGAL抗体和UCP标记Cr; (4) 分析膜上设有平行的两个检测线T1、T2和一个质控线C，两个检测线T1、T2分别包被 抗NGAL抗体和抗Cr抗体，且两者可以相互对调；质控线包被抗UCP标记抗体来源动物免疫球 蛋白的抗体； 所述衬板用于支撑样品垫或UCP结合垫、分析膜和吸收垫的组装，所述UCP结合垫用于 结合UCP标记抗NGAL体和UCP标记Cr，所述分析膜用于检测线和质控线的设置从而实现NGAL 和Cr的定量及免疫层析试纸条的质控，所述吸收垫用于收集分析后的样品溶液。2. 如权利要求1所述的一种基于上转换发光技术的联合定量检测uNGAL和uCr装置，其 特征在于:A、B两类免疫层析试纸条的样品垫或UCP结合垫、分析膜、吸收垫及衬板的宽度一 致，均为4~5.5mm，样品垫和UCP结合垫的长度为5~10mm，分析膜的长度为25~40mm，吸收 垫的长度为20~30mm，衬板的长度等于前后搭接组装后样品垫或UCP结合垫、分析膜及吸收 垫的长度总和。3. 如权利要求1所述的一种基于上转换发光技术的联合定量检测uNGAL和uCr装置，其 特征在于:其中样品垫和UCP结合垫的材料为玻璃纤维素膜或具有类似性质的膜材料，分析 膜的材料为硝酸纤维素膜或具有类似性质的膜材料，吸收垫的材料为吸水滤纸或具有类似 功能的材料，衬板的材料为具有自粘贴性质聚氯乙烯胶板或具有类似功能的材料。4. 如权利要求1所述的一种基于上转换发光技术的联合定量检测uNGAL和uCr装置，其 特征在于:A类免疫层析试纸条的使用是将标准品工作液用样品稀释液进行2倍梯度稀释法 进行稀释，获得标准品浓度梯度溶液;将尿液样品用样品稀释液稀释10~100倍;取25~100 yL上述标准品浓度梯度溶液或尿液样品稀释液分别复孔加入相应的96孔板的孔中或类似 结构的容器当中，然后在上述96孔板中再各加入25~100yL经稀释的UCP标记抗NGAL抗体溶 液和UCP标记Cr溶液组成的混合溶液，混匀制成悬液;接着将A类免疫层析试纸条的样品垫 端垂直浸入上述悬液中，等待5~30min后取出水平放置5~20min后进行UCP信号采集。5. 如权利要求1所述的一种基于上转换发光技术的联合定量检测uNGAL和uCr装置，其 特征在于:B类免疫层析试纸条的使用是将标准品工作液用样品稀释液进行2倍梯度稀释法 进行稀释，获得标准品浓度梯度溶液;接着将尿液样品用样品稀释液稀释10~100倍;接着 将B类免疫层析试纸条水平放置后，加20~100yL的标准品浓度梯度溶液或尿液样品稀释液 至UCP结合垫上，等待10~30min后进行UCP信号采集。6. 如权利要求1所述的一种基于上转换发光技术的联合定量检测uNGAL和uCr装置，其 特征在于:UCP是平均粒径为200~600nmol/L的经二氧化硅包被和表面功能化修饰的由稀 土金属元素所构成的晶体材料。7. 如权利要求1所述的一种基于上转换发光技术的联合定量检测uNGAL和uCr装置，其 特征在于:UCP标记抗NGAL抗体包括UCP标记抗单体NGAL抗体、UCP标记抗同二聚体NGAL抗 体、UCP标记抗MMP-9抗体或UCP标记抗上述三种分子形式NGAL抗体。8. 权利要求1所述的一种基于上转换发光技术的联合定量检测uNGAL和uCr装置的制备 方法，其步骤如下： 1) 所述样品稀释液冻干粉的制备，是将2〇1111^!1 = 7.2~7.5，含150~25〇111111〇1/1恥(：1、 0.25~0.5%(￥〇1八〇1)1?^611-20、0.5%~2%(￥1:八〇1)133厶或2.5%~5%(￥1:八〇1)脱脂奶 粉的50~100mmol/L HEPES缓冲液经机械或磁力搅拌充分后，采用0.22μπι或0.45μπι滤器进 行过滤除菌和除去不溶性杂质，经冻干后室温保存;样品稀释液冻干粉使用前加入20mL去 离子水充分溶解后获得样品稀释液； 2) 所述NGAL和Cr标准品冻干粉的制备，标准品A是将60ng单体NGAL和6μπιο 1 Cr溶于300 41^、？!1 = 7.4且含5~10%海藻糖（￥七八〇1)的？83溶液中得到的含200叫/11^单体呢41^和 20mmol/L Cr的溶液，过滤除菌后采用常规方法冻干后室温保存;标准品B是将60ng同二聚 体NGAL和6μπιο1 Cr溶于30(^1^、？!1 = 7.4且含5~10%海藻糖(￥七八〇1)的？83溶液得到的含 200ng/mL同二聚体NGAL和20mmol/L Cr的溶液，过滤除菌后采用常规方法冻干后室温保存； 标准品C是将60ng异二聚体NGAL和6μπιο1 Cr溶于30(^1^!1 = 7.4且含5~10%海藻糖(￥七/ vol)的PBS溶液得到的含200ng/mL异二聚体NGAL和20mmol/L Cr的溶液，过滤除菌后采用常 规方法冻干后室温保存；标准品D是将24ng单体NGAL、24ng同二聚体NGAL、12ng异二聚体 NGAL和6μπιο1 Cr溶于30(^1^、？!1 = 7.4且含5~10%海藻糖（￥以￥〇1)的？83溶液得到的含 200ng/mL NGAL和20mmol/L Cr的溶液，过滤除菌后采用常规方法冻干后室温保存；以上标 准品冻干粉使用前加入去离子水300yL混匀制备成标准品工作液； 3. UCP标记抗NGAL抗体抗体和UCP标记Cr，具体制备方法是按0.5mL/cm2的用量将UCP标 记抗NGAL抗体溶液和UCP标记Cr溶液组成的混合溶液均匀滴加在UCP结合垫上，30°C~35°C 干燥后制得； 4. T1、T2及C的包被方法是利用手工方法或专用的点样仪在分析膜上依次均匀喷涂抗 NGAL抗体溶液、抗Cr抗体溶液及抗UCP标记抗体来源动物免疫球蛋白的抗体;抗体溶液是将 抗体溶于抗体缓冲液后得到，抗体浓度为lmg/mL，抗体缓冲液为含1 % (vo 1/vo 1)甲醇、pH= 8.0的lOOmM Tris-HCL溶液液;最终喷涂量为0.025~0.05mL/mm，相当于每毫米T1、了2或(：线 喷涂25ng~50ng抗体； 5) 衬板、样品垫或UCP结合垫、分析膜及吸收垫相互搭接后粘于衬板上。
【文档编号】G01N33/577GK105842464SQ201610404263
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年6月12日
【发明人】蔡林君, 陈雷, 杨津, 赵冰, 姜春来, 孔维
【申请人】吉林大学